Laporan Resmi Praktikum Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret PDF

Preview

Summary

LAPORAN RESMI PRAKTIKUMLABORATORIUM :BIOKIMIAPRAKTIKUM :BIOKIMIAJUDUL PERCOBAAN :PENENTUAN KADAR PROTEINDENGAN METODE BIURETOleh :Nama : Nabila Estiani Alsari NIM :18030234034 Kls : KBProgram/Jurusan : S1 KimiaJURUSAN KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS NEGERI SURABAYAA. Ju...

Description

LAPORAN RESMI PRAKTIKUM

LABORATORIUM

:BIOKIMIA

PRAKTIKUM

:BIOKIMIA

JUDUL PERCOBAAN :PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BIURET

Oleh :

Nama : Nabila Estiani Alsari NIM :18030234034 Kls : KB2018

Program/Jurusan : S1 Kimia

JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI SURABAYA

A. Judul Percobaan

: Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

B. Hari / Tanggal Percobaan : Rabu / 15 September 2021 / Pukul 13.00 WIB C. Selesai Percobaan

: Rabu / 15 September 2021 / Pukul 15.30 WIB

D. Tujuan Percobaan

: Menentukan kadar protein yang ada pada sampel dengan menggunakan cara biuret

E. Dasar Teori 1) Protein Protein adalah sumber asam amino terdiri atas rantai-rantai panjang asam amino, yang te rikat satu sama lain dengan ikatan peptida yang mengandung unsur- unsur C, H, O dan N. Protein merupakan suatu zat makanan yang amat penting bagi tubuh, kare na zat ini disamping berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh juga berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur dalam tubuh (Budiyanto, 2004). Protein adalah makromolekul polipeptida yang te rsusun dari sejumlah asam amino yang dihubungka n ole h ikatan peptida, suatu senyawa organik yang berbobot molekul tinggi berkisar antara beberapa ribu sampai jutaan dan tersusun dari atom C, H, O dan N yang membentuk unit-unit asam amino. Suatu molekul protein disusun oleh

sejumlah oleh sejumlah asam amino tertentu, urutan susunan asam

amino dalam protein maupun hubungan antara asam amino yang satu dan asam amino lainnya (Girindra, 1986).

Struktur Protein Protein merupakan molekul besar dengan berat molekul bervariasi antara 5000 sampai jutaan. Protein akan menghasilkan asam-asam amino jika terhidrolisis oleh asam atau enzim. Ada 20 jenis asam amino yang terdapat

dalam molekul protein. Asam-asam amino ini terikat satu sama lain dengan ikatan peptida. Komposisi rata-rata unsur kimia yang terdapat dalam molekul protein yaitu sebagai berikut : karbon 50%, hidrogen 7%, oksigen 23%, nitrogen 16%, belerang 0-3%, dan fosfor 0-3%. Dengan berpedoman pada kadar nitrogen sebesar 16%, dapat dilakukan penentuan kandungan protein dalam suatu bahan makanan (Poedjiadi, 2006). Protein secara umum mempunyai serapan maksimal pada 214 nm karena adanya ikatan peptida. Namun daerah ini banyak terganggu karena adanya uap air dari udara sehingga pada praktiknya sulit dilakukan. Asam amino tyrosin, tryptophan, dan phenylalanin memiliki absorbansi pada serapan maksimum sekitar 280 nm karena adanya cincin aromatik dalam strukturnya. Warburg Chistian Method mengusulkan persamaan berikut untuk menghitung kadar protein, khususnya dengan memperimbangkan kesalahan yang mungkin timbul karena serapan asam nukleat yang secara maksimal terjadi pada 260 nm. Protein ditinjau dari strukturnya dibagi menjadi dua golongan besar yaitu golongan protein sederhana dan protein gabungan. Protein sederhana adalah protein yang terdiri atas molekul-molekul asam amino. Berdasarkan bentuk molekulnya dibagi menjadi 2 yaitu protein fiber dan protein globular. Sedangkan protein gabungan adalah protein yang terdiri atas protein dan gugus bukan protein. Albumin merupakan salah satu protein sederhana dengan bentuk molekul protein globular. Albumin mempunyai sifat dapat larut dalam air serta dapat terkoagulasi oleh panas. Larutan albumin dalam air dapat diendapkan dengan penambahan ammonium sulfat hingga jenuh.

2) Penentuan Kadar Protein Metode Biuret Metode biuret merupakan salah satu metode penentuan kadar protein dengan menggunakan larutan Biuret pada suasana basa bereaksi dengan ikatan peptida dari protein mengakibatkan terjadinya perubahan warna dari larutan Biuret yang berwarna biru menjadi berwarna ungu. Perubahan warna yang teramati diukur intesitas serapan panjang gelombangnya menggunakan spektrofotometri UV-Vis. Semakin tinggi intensitas cahaya yang diserap oleh

spektrofotometer UV-Vis maka semakin tinggi pula kadar protein yang terdapat dalam zat tersebut (Jubaidah, 2016). Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO4 en cer. Uji ini menunjukkan adanya senyawa-senyawa yang mengandung gugus amida (−CONH2), dengan demikian uji biuret tidak hanya untuk protein tetapi zat lain juga memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah-violet atau biru-violet (Sudarmadji, 1989).

3) Spektrofotometri UV-Vis Spektrum

UV-Vis

merupakan

hasil

interaksi

antara

radiasi

elektromagnetik dengan molekul. Bentuk energi radiasi elektromagnetik mempunyai sifat gelombang dan partikel (foton). (Harmita, 2006). Besarnya tenaga foton berbanding lurus dengan frekuensi dari radiasi elektromagnetik dinyatakan dengan rumus: E = hv Dimana: E = Energi ( Joule.molekul-1 ) h = Tetapan Planck = 6,63.10-34 Joule.S.molekul-1 v = Frekuensi (S-1 )

Pengukuran serapan dapat dilakukan pada panjang gelombang daerah ultraviolet (panjang gelombang 190 nm – 380 nm) atau pada daerah cahaya tampak (panjang gelombang 380 nm – 780 nm). Pengukuran serapan dari suatu sampel dapat dilakukan dengan perhitungan Lambert-Beer sebagai berikut : A=

Log Io Log It

= ɛ. b.c = a. b. c

Dimana : A= serapan; a = daya serap; b = tebal lapisan zat yang menyerap sinar (kuvet) (cm); c = kadar (g/L); ɛ = absorbsivitas molekuler (mol.cm.L -1 ); Io = intensitas sinar datang; It = intensitas sinar yang diteruskan. Semakin tinggi intensitas cahaya yang diserap oleh spektrofotometer UVVis maka semakin tinggi pula kadar protein yang terdapat dalam zat tersebut (Jubaidah, 2016).

4) Ikan Lele Ikan lele (Clarias gariepinus) merupakan salah satu komoditas perikanan yang cukup popular di masyarakat karena berbagai kelebihan, diantaranya; pertumbuhannya cepat, memiliki kemampuan adaptasi terhadap lingkungan tinggi, rasa yang enak, kandungan gizi yang cukup tinggi serta harga yang murah. Komposisi gizi ikan lele meliputi protein (17,7%), lemak (4,8%), mineral (1,2%), dan air (76%) (Ubadillah, 2010). Keunggulan ikan lele dibandingkan dengan produk hewani lainnya yaitu kaya akan leusin dan lisin. Leusin (C6H13NO2) merupakan asam amino esensial yang diperlukan untuk pertumbuhan anak, menjaga keseimbangan nitrogen dan pembentukkan protein otot. Sedangkan lisin merupakan satu dari 9 asam amino esensial yang dibutuhkan untuk pertumbuhan dan perbaikan jaringan (Ubadillah, 2010).

F. Alat dan Bahan 1) Alat  Tabung reaksi

10 buah

 Spektrofotometri UV-VIS

1 buah

 Rak tabung reaksi

1 buah

 Mortar alu

1 buah

 Gelas ukur 10 mL

3 buah

 Pipet volume 10 mL

1 buah

 Pro pipet

1 buah

 Waterbath

1 buah

 Neraca analitik

1 buah

 Sentifuge

1 buah

 Tabung sentrifuge

1 buah

 Gelas kimia 250 mL

2 buah

 Labu ukur 10 mL

1 buah

 Spatula

1 buah

 Kaca arloji

1 buah

2) Bahan  Larutan standart protein (albumin)

5 mL

 Reagen biuret

85 mL

 Aquades

secukupnya

 Sampel protein (sampel padat)

1 gram

G. Alur Percobaan 1) Persiapan Sampel 1 gram sampel  Dihaluskan dengan mortar dan alu  Ditambahkan 10mL aquades  Dihomogenkan Larutan sampel  Disentrifuge 3500 rpm ±10 menit  Didekantasi

Endapan

Filtrat

2) Pembuatan Standart 1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

larutan

larutan

larutan

larutan

larutan

sampel

sampel

sampel

sampel

sampel

protein

protein

protein

protein

protein

kadar 1 mg

kadar 2 mg

kadar 3 mg

kadar 4 mg

kadar 5 mg

 Ditambahkan 15 mL reagen biuret  Dihomogenkan  Diinkubasi pada 37oC selama 10 menit Larutan berwarna ungu  Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm Nilai absorbansi

Reaksi : -

CuSO4.5H2O(s) + 2NaOH (aq) → Cu(OH)2 (aq) + Na2SO4(aq).5H2O(l)

-

Cu(OH)2 (aq) → Cu2+ (aq) + 2OH- (aq)

-

Senyawa kompleks peptide berwarna ungu

3) Penetapan absorbansi larutan blanko 1mL aquades    

Dimasukkan kedalam tabung reaksi Ditambahkan 5 mL reagen biuret Dihomogenkan Diinkubasi pada 37oC selama 10 menit

Larutan warna ungu  Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm Nilai absorbansi

4) Penetapan absorbansi larutan sampel 1mL sampel    

Dimasukkan kedalam tabung reaksi Ditambahkan 5 mL reagen biuret Dihomogenkan Diinkubasi pada 37oC selama 10 menit

Larutan warna ungu  Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm Nilai absorbansi

Reaksi : -

CuSO4.5H2O(s) + 2NaOH (aq) → Cu(OH)2 (aq) + Na2SO4(aq).5H2O(l)

-

Cu(OH)2 (aq) → Cu2+ (aq) + 2OH- (aq)

-

Senyawa kompleks peptide berwarna ungu

H. Hasil Pengamatan No

Prosedur Percobaan

Perc. 1.

Hasil Pengamatan Sebelum

Persiapan Sampel

Dugaan / Reaksi

Sesudah

- Daging ikan lele : - Sampel ikan lele Kandungan protein ikan berwarna

1 gram sampel

putih

kecoklatan  Dihaluskan dengan mortar dan alu  Ditambahkan 10mL aquades  Dihomogenkan

- Aquades : larutan tidak berwarna

+

aquades

larutan berwarna gram (Astawan, 2008) putih kecoklatan - Filtrat

sampel

ikan lele keruh Larutan sampel  Disentrifuge 3500 rpm ±10 menit  Didekantasi

Endapan

Filtrat

: lele yaitu 17,7 gram/100

Kesimpulan

No Perc. 2.

Hasil Pengamatan Prosedur Percobaan Pembuatan Larutan Standart

Sebelum - Larutan

Dugaan / Reaksi

Sesudah

standar - larutan

standart - CuSO4.5H2O(s)

Kesimpulan + Semakin

1 mL larutan sampel protein

protein : larutan protein + reagen

2NaOH (aq) → Cu(OH)2 tinggi

kadar 1mg, 2mg, 3mg, 4mg,

tidak berwarna

(aq)

dan 5mg  Ditambahkan 15 mL reagen biuret  Dihomogenkan  Diinkubasi pada 37oC selama 10 menit Larutan berwarna ungu

biuret :

- Reagen biuret : - 1 mg : larutan

+ konsentrasi

Na2SO4(aq).5H2O(l)

biru

(aq) + 2OH- (aq)

- 2 mg : larutan berwarna

biru

(++)

berwarna

ungu

(+) Nilai absorbansi

- 4 mg : larutan berwarna

semakin tinggi

- 3 mg : larutan  Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm

maka

nilai

larutan berwarna berwarna biru (+) - Cu(OH)2 (aq) → Cu2+ absorbansinya

ungu

(++) - 5 mg : larutan Senyawa kompleks berwarna ungu peptide berwarna ungu

(+++) - Nilai absorbansi standart ikan lele: - 1 mg : 0,091 - 2 mg : 0,125 - 3 mg : 0,173 - 4 mg : 0,225 - 5 mg : 0,273

No Perc. 3.

Hasil Pengamatan Prosedur Percobaan

Dugaan / Reaksi Sebelum

Penetapan Absorbansi Larutan Blanko

- Aquades : larutan - Larutan blanko + tidak berwarna

1mL aquades  Dimasukkan kedalam tabung reaksi  Ditambahkan 5 mL reagen biuret  Dihomogenkan  Diinkubasi pada 37oC selama 10 menit Larutan warna ungu  Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm Nilai absorbansi

Sesudah

- Reagen

biuret : larutan

biuret berwarna biru

larutan berwarna - Absorbansi biru

blanko ikan lele : 0,056

Kesimpulan

No Perc. 4.

Hasil Pengamatan Prosedur Percobaan

Dugaan / Reaksi Sebelum

Penetapan Absorbansi Larutan Sampel 1mL sampel

Kesimpulan

Sesudah

- Sampel protein : - Larutan

sampel -

CuSO4.5H2O(s)

larutan berwarna ikan lele + reagen

2NaOH

putih keruh

Cu(OH)2

biuret : larutan

(aq)

+ Berdasarkan → percobaan

(aq)

+  Dimasukkan kedalam tabung reaksi - Reagen biuret : berwarna Na2SO4(aq).5H2O(l) ungu  Ditambahkan 5 mL reagen biuret - Cu(OH)2 (aq) → Cu2+ larutan berwarna (+)  Dihomogenkan (aq) + 2OH- (aq) - Absorbansi  Diinkubasi pada 37oC selama 10 menit biru sampel ikan lele : Larutan warna ungu  Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm

0,2998 - kadar

yang dilakukan didapatkan kadar protein ikan lele

protein

ikan lele : 5,6% Nilai absorbansi

Senyawa kompleks peptide berwarna ungu

sebesar 5,6%

I. Analisis dan Pembahasan Percobaan Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret ini bertujuan untuk menentukan kadar protein yang ada pada sampel dengan menggunakan metode biuret. Prinsip dari percobaan ini yaitu berdasarkan pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks peptida berwarna ungu yang terjadi dalam suasana basa. Dalam suasana basa, ion Cu2+ akan membentuk senyawa kompleks dengan ikatan peptida suatu protein atau yang biasa disebut ikatan kompleks Cu peptida dengan absorbansi maksimal pada 540 nm. Metode biuret digunakan karena pelaksanaannya yang mudah dan bahannya murah dan mudah didapatkan. Jika menggunakan metode lainnya akan membutuhkan waktu yang lebih lama, bahan yang digunakan juga mudah korosif dan membutuhkan waktu yang tinggi sehingga pada penggunaan skala laboratorium metode biuret lebih efektif dan mudah dibandingkan metode lainnya. Sampel yang digunakan yaitu ikan lele, kandungan pada ikan lele meliputi protein (17,7%), lemak (4,8%), mineral (1,2%), dan air (76%) (Ubadillah, 2010). Keunggulan ikan lele dibandingkan dengan produk hewani lainnya yaitu kaya akan leusin dan lisin. Percobaan ini memiliki empat tahapan, yaitu persiapan sampel, pembuatan larutan standart, penetapan absorbansi larutan Blankodan penetapan absorbansi larutan sampel. 1) Persiapan Sampel Persiapan sampel bertujuan untuk mempersiapkan daging ikan lele menjadi suatu larutan yang akan digunakan dalam langkah percobaan selanjutnya supaya dapat bisa diukur nilai absorbansinya. Mula-mula sebanyak 1 gram sampel ikan lele (berwarna putih kecoklatan) dihaluskan dengan mortar dan alu. Penghalusan sampel menggunakan mortar dan alu bertujuan untuk memperluas permukaan sampel untuk mempermudah pengukuran nilai absorbansi sehingga nilainya tidak kurang atau lebih dari batas LOD (limit deteksi). Lalu ditambahkan 10 mL aquades dan pada sampel dan dihomogenkan untuk melarutkan albumin atau protein karena yang digunakan dalam percobaan ini adalah filtratnya. Setelah itu terbentuk larutan sampel yang berwarna putih kecoklatan lalu di sentrifuge 3500 rpm selama ±10 menit. Tujuan sentrifuge yaitu untuk memisahkan residu dan filtratnya dengan gaya sentrifugal dengan adanya gaya sentrifugal tersebut

menyebabkan residu pada sampel akan mengendap sehingga filtrat dan residu akan memisah. Tidak menggunakan kertas saring pada proses pemisahan, karena akan menyebabkan residu tersaring bercampur dengan filtratnya sehingga dapat mengganggu penetapan nilai absorbansinya, pada larutan serapan cahaya akan berbeda, karena adanya eksitasi elektron yang mengakibatkan struktur molekul berbeda, orbitalnya berbeda dan nilai absorbansinya akan berbeda. Kemudian didekantasi larutan sampel dengan tujuan memisahkan campuran larutan dan padatan dengan menuangkan cairan secara perlahan sehingga endapan tertinggal di bagian dasar tabung reaksi. Filtrat yang dihasilkan pada sampel ikan lele berwarna keruh. 2) Pembuatan Larutan Standart Pembuatan larutan standar bertujuan untuk standarisasi larutan sehingga didapatkan konsentrasi sampel untuk digunakan dalam pembuatan kurva standar sebagai tolak ukur perhitungan kadar protein dalam sampel. Pada percobaan ini terlebih dahulu membuat lima larutan standar dengan kadar yang berbeda- beda, yaitu 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, dan 5 mg dari larutan induk yang sama me lalui proses pengenceran bertingkat. Pengenceran bertingkat digunakan karena dapat menghemat bahan yang digunakan, tetapi memiliki kelemahan pada proses pengenceran awal dan pengenceran selanjutnya harus saling berhubungan karena jika terdapat kesalahan pengenceran di awal maka akan berpengaruh pada pengenceran selanjutnya. Larutan standarisasi menggunakan induk protein berupa albumin karena albumin merupakan protein yang mayoritas terdapat dalam makhluk hidup, sehingga jika digunakan untuk perbandingan maka hasilnya tidak jauh berbeda Setelah itu, masing- masing larutan standar protein (larutan tidak berwarna) dari kadar yang berbeda- beda tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 1 mL. Lalu masing- masing tabung reaksi ditambahkan 5 mL reagen biuret (larutan berwarna biru) dan dan dihomogenkan. Reagen biuret dapat dibuat dengan mencampurkan larutan NaOH , CuSO4, dan natrium kalium tartat. CuSO4 berfungsi sebagai penyedia ion Cu2+ yang nantinya akan membentuk kompleks protein, kalium natrium tartat berfungsi untuk mencegah terjadinya

reduksi pada Cu2+ supaya tidak mengendap, kemudian NaOH untuk memberi suasana basa yang akan membantu proses pembentukan Cu(OH) 2 yang akan terpecah menjadi Cu2+ dan 2OH-. Persamaan reaksi dari larutan standar dan reagen biuret adalah sebagai berikut:

CuSO4.5H2O(s) + 2NaOH (aq) → Cu(OH)2 (aq) + Na2SO4(aq).5H2O(l)

Penambahan biuret bertujuan untuk memberi warna pada larutan karena dalam pengujian ini menggunakan spektrofotometri yang hanya mampu membaca rentang Panjang gelombang pada daerah visible sehingga larutannya harus berwarna. Pada reaksi diatas menunjukkan terjadinya perubahan warna larutan yang awalnya tidak berwarna menjadi biru. Pada 1 mg protein menghasilkan larutan berwarna biru (+), 2 mg protein menghasilkan larutan berwarna biru (++), 3 mg protein menghasilkan larutan berwarna ungu (+) , 4 mg protein menghasilkan larutan berwarna ungu (++), 5 mg protein menghasilkan larutan berwarna ungu (+++). Hal ini dikarenakan ion Cu 2+ dalam pereaksi biuret dapat membentuk kompleks dengan ikatan peptida pada larutan induk protein, yang sesuai dengan reaksi di bawah ini.

Kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 10 menit yang bertujuan mempertahankan suhu optimum dari setiap larutan standart protein dan mempercepat reaksi agar menstabilkan senyawa kompleks yang terbentuk dari reaksi antara ion Cu2+ dan ikatan peptida dalam larutan induk protein. Setelah itu diukur absorbansi larutan standar ini pada panjang gelombang 540 nm dengan alat spektrofotometer UV-Vis. Panjang gelombang yang digunakan 540 nm karena

pada panjang gelombang 540 warna yang dapat diserap yaitu warna hijau dan warna ungu sesuai dengan warna sampel yang dihasilkan selain itu juga karena rentang panjang gelombang optimum pada senyawa ikatan kompleks peptida berada pada 540 nm. Hasil absorbansinya adalah sebagai berikut:

Konsentrasi (mg/ml) 1 2 3 4 5

Absorbansi 0,091 0,125 0,173 0,225 0,273

Dari data konsentrasi dan absorbansi pada larutan standar tersebut, didapatkan kurva seperti berikut ini.

Kurva Larutan Standart Protein dengan Absorbansi 0.3

y = 0.0464x ...