LBQ P#7 - Practica 7. Laboratorio de bioquímica PDF

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Universidad Autónoma de Baja California Faculta de ingeniería Profa. Susana Norzagaray Plasencia Laboratorio de bioquímica Reporte #7 ¨Actividad enzimática y factores que la afectan ¨ I. Objetivo Estudiar los factores que afectan la actividad enzimática y comprender la especificidad de las enzimas p...

Description

Universidad Autónoma de Baja California Faculta de ingeniería

Profa. Susana Norzagaray Plasencia Laboratorio de bioquímica

Reporte #7 ¨Actividad enzimática y factores que la afectan ¨

I. Objetivo Estudiar los factores que afectan la actividad enzimática y comprender la especificidad de las enzimas por el sustrato. II. Marco teórico Una enzima es una proteína que cataliza las reacciones bioquímicas del metabolismo. Las enzimas actúan sobre las moléculas conocidas como sustratos y permiten el desarrollo de los diversos procesos celulares. Es importante determinar además de todo lo expuesto que las enzimas se caracterizan por contar con una serie de señas de identidad propias que las determinan en todos y cada uno de sus aspectos. En este sentido podemos exponer, por ejemplo, que poseen la capacidad para contar con unos tamaños muy diferentes de tal modo que hay desde las que tienen 2500 aminoácidos hasta las que rondan los 50. La actividad enzimática es una medida de la cantidad de enzima activa presente y del nivel de actividad de la misma, por lo que la medida de la actividad es dependiente de las condiciones, que deben ser especificadas cuando se dan valores de actividad. La actividad expresa la cantidad de sustrato convertido por unidad de tiempo, teniendo en cuenta el volumen de reacción. Factores que afectan la actividad enzimática. Concentración del sustrato. A mayor concentración del sustrato, a una concentración fija de la enzima se obtiene la velocidad máxima. Después de que se alcanza esta velocidad, un aumento en la concentración del sustrato no tiene efecto en la velocidad de la reacción. Concentración de la enzima. Siempre y cuando haya sustrato disponible, un aumento en la concentración de la enzima aumenta la velocidad enzimática hacia cierto límite. Temperatura. Un incremento de 10°C duplica la velocidad de reacción, hasta ciertos límites. El calor es un factor que desnaturaliza las proteínas por lo tanto si la temperatura se eleva demasiada, la enzima pierde su actividad. PH. El pH óptimo de la actividad enzimática es 7, excepto las enzimas del estómago cuyo pH óptimo es ácido. Presencia de cofactores. Muchas enzimas dependen de los cofactores, sean activadores o coenzimas para funcionar adecuadamente. Para las enzimas que tienen cofactores, la concentración del cofactor debe ser igual o mayor que la concentración de la enzima para obtener una actividad catalítica máxima. III. Materiales y equipo Parte I  3 tubos de ensaye,  Soporte universal con anillo,  Tela de asbesto,

 

Vaso de precipitados de 250 ml, Estufa 37°C.

Reactivos  Saliva diluida 1 a 5 con agua destilada,  Cubos de hielo  Almidón al 1% disuelto en NaCl 0.3%,  Lugol Parte II  3 tubos de ensaye,  Parrilla de calentamiento  Baño María (37°C)  Vaso de pp de 250 ml  3 pipetas de10 ml. Reactivos  Fosfato sódico disustituido (dibásico) 0.2 M (A),  Ácido cítrico 0.1 M (B).  Soluciones amortiguadoras:  PH 5.0: se mezclan 5.15 ml de A con 4.85 de B;  PH 6.8: se mezclan 7.725 ml de A con 2.275 de B;  PH 8.0: se mezclan 9.725 de A con 0.275 de B.  Solución salival,  Almidón 1%,  Lugol Parte III  4 tubos de ensaye,  Pipetas,  Incubadora Reactivos  Almidón al 1%  Sacarosa al 2%  Saliva diluida  sacarasa (10 g levadura se homogeneizan en 100 ml de agua),  Lugol,  Licor de Fehling.

IV. Desarrollo Se preparó una dilución de saliva 1 a 5 con agua destilada que se usaría para todas las siguientes partes del desarrollo: 1. Se calculó la cantidad de saliva diluida que se utilizaría en las primeras dos partes de la practica (ya que la tercera fue en el siguiente laboratorio). 2. Se usarían aproximadamente 12 ml por equipo, por lo tanto serian extraídos, 3 ml de saliva más 12 ml de agua destilada. 3. Se agregaron los 3 ml a una probeta, y 12ml de agua destilada, aforando hasta 15 ml 4. Para la parte III se hizo el paso 3.

Parte I. labilidad térmica de las enzimas 1. Se rotularon los 3 tubos de ensayo como T-1, T-2 y T-3, se les colocaron 2 ml de solución salival. 2. El tubo T-1 se calentó a baño María a 100 grados centígrados por 1 min y se dejó enfriar. 3. A los tubos T-1, T-2 y T-3 se le añadieron 4 ml de disolución de almidón. 4. El tubo T-3 se sumergió en hielo durante aproximadamente 10 minutos. 5. Se incubaron los tubos T-1 y T-2 a 37 grados centígrados durante 10 minutos. 6. Después de tener de nuevo los tres tubos se les añade una gota de lugol a cada uno. Parte II. Influencia del PH sobre la actividad enzimática 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Se prepararon las soluciones amortiguadoras como se indica en reactivos, parte II. Se rotularon 3 tubos de ensaye como T-A, T-B y T-C Al T-1 se le agregaron 2 ml de solución amortiguadora PH 5 Al T-2 se le agregaron 2 ml de solución amortiguadora PH 6.8 Al T-3 se le agregaron 2 ml de solución amortiguadora PH 8 A cada uno de los tubos se le agregó 2 ml de amilasa salival y 4 ml de solución de almidón. 7. Se mezclaron y se incubaron a 37 grados centígrados durante 10 min. 8. Después de haber transcurrió el tiempo se le agregaron una gota de lugol a cada tubo. Parte III. Especificidad de las enzimas (individual) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Se rotularon 4 tubos de ensaye como T-1, T-2, T-3. En los tubos T-1 y T-2 se colocaron 4 ml de solución de almidón. En los tubos T-3 y T-4 se colocaron 4 ml de solución de sacarosa. En los tubos T-1 y T-3 se adicionaron 2 ml de amilasa salival. En los tubos T-2 y T-4 se adicionaron 2 ml se sacarasa. Se agitaron los tubos y se incubaron a 37 grados centígrados durante 10 minutos. A los tubo T-1 y T-2 se les agregó una gota de lugol A los tubos restantes se le adicionaron 1 ml de reactivo de Fehling. Se calentaron en baño hirviente durante 5 minutos.

V. Resultados Parte I. labilidad térmica de las enzimas Tubo

Enzima

Condiciones

Sustrato

Incubación

T-1 T-2

Amilasa Amilasa

Desnaturalizada Nativa

Almidón Almidón

37 C 37 C

T-3

Amilasa

Desnaturalizada

Almidón

-10 C

Coloración con lugol Morado Gris con fondo amarillo Gris

Parte II. Influencia del PH sobre la actividad enzimática Tubo

Enzima

PH del medio

Sustrato

Incubación

T-1

Amilasa

5

Almidón

37 C, 10 min

T-2

Amilasa

6.8

Almidón

37 C, 10 min

T-3

Amilasa

8

Almidón

37 C, 10 min

Parte III. Especificidad de

Coloración con lugol Plomo, amarillo y blanco Gris oscuro con fondo amarillo Blanco con gris

las enzimas (individual)

Tubo

Enzima

Sustrato

Incubación

Reactivo

T-1

Amilasa

Almidón

37 C, 10 min

Lugol

Coloración con lugol Verde oscuro

T-2 T-3 T-4

sacarosa Amilasa Sacarosa

Almidón Sacarosa Sacarosa

37 C, 10 min 37 C, 10 min 37 C, 10 min

Lugol Fehling Fehling

en el fondo Morado Verde claro Azul claro

VI. Datos

experimentales NULO VII. Observaciones En algunos tubos de ensayo, el cambio era casi instantáneo, al contrario de otros que tenían que agitarse para poder visualizar el cambio. Hubo algunas precipitaciones en las que intervienen los factores como la temperatura, acidez o basicidad del medio. VIII. Conclusiones y recomendaciones

La amilasa reacciona mejor con un pH casi neutro. Lo que hace la amilasa es que degrada el almidón. El pH óptimo para que la amilasa realice su actividad enzimática está dentro del rango de 6.8 a 8. Ya que el PH debe ser el adecuado porque es una proteína que tiene a

desnaturalizarse fácilmente si son expuestos a factores extremos. En cuanto a un ácido una base fuertes la enzima se desnaturaliza y tiende a precipitarse de la solución acuosa. Las enzimas dependen de dos factores importantes para su actividad enzimática, siendo la temperatura y el PH del medio....