LE Librerie Genomiche O Genoteche PDF

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APPUNTI DETTAGLIATI...

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LE LIBRERIE GENOMICHE O GENOTECHE P.B166 Sono delle provette e ogni provetta contiene l’intero genoma di un organismo vivente come una grande libreria dove ogni scaffale contiene i libri di un autore. Una genoteca contiene tante provette e all’interno di ogni provetta c’è l’intero genoma/ l’intero dna di un organismo vivente/cellula. Come si fa una genoteca? La genoteca può essere utile per trovare un gene di cui si conosce la funzione ma non si sa dove si trova nel genoma dell’individuo, per trovare quindi un gene d’interesse. Per costruire la genoteca si taglia l’intero genoma di un individuo in numerosi frammenti con gli enzimi di restrizione, ogni frammento di questo dna viene usato per creare un dna ricombinante nel senso che viene attaccato ad un vettore di clonaggio e poi inserito in una cellula batterica. Avremo quindi diverse cellule batteriche ed ogni cellula batterica avrà inglobato un vettore di clonaggio con un pezzo del nostro dna iniziale. Poi le cellule si riproducono e formano diversi cloni replicandosi e replicano anche il pezzo di dna che hanno inglobato, ciò quello estraneo presente nel frammento del vettore di clonaggio. Dalla clonazione di questi batteri, detta SHOTGUN (clonazione rapida), noi avremo tanti cloni batterici e ogni clone avrà un frammento del nostro dna iniziale. Se tutti questi cloni batterici li mettiamo in una provetta creiamo una genoteca. Quindi una genoteca contiene diversi frammenti del dna e di ogni frammento ne contiene diverse copie poiché ogni clone batterico è costituito da diverse cellule. La genoteca corrisponde ad una biblioteca, solo che qui abbiamo una provetta che contiene l’intero genoma dell’organismo. La genoteca umana per es. è stata ottenuta usando come vettori i FAGI o BATERRIOFAGI che sono i virus dei batteri ed è costituita da circa un milione di crisi viene detta GENOTECA RIDONDANTE poiché in una provetta (nella genoteca quindi) ci sono più copie di uno stesso gene quindi più copie di uno stesso pezzo dna iniziale. Esistono 2 tipi di genoteche: 1) GENOTECA GENOMICA che consiste in una collezione di frammenti di dna di un intero genoma di un organismo è detta anche ORGANISMO SPECIFICO 2) GENOTECA DI cDNA (dna complementare) o GENOTECA DI ESPRESSIONE e si ottiene partendo dal dna complementare (cDNA). Si isolano da una cellula di un individuo gli rna messaggeri quindi un filamento d rna messaggero viene fatto duplicare da un enzima che si chiama TRASCRITTASI INVERSA. Questo enzima è presente nei RETROVIRUS virus che hanno come acido nucleico non il dna, ma l’rna. Quindi quando questi virus attaccano la cellula ospite, all’interno della cellula ospite iniettano un filamento di rna e questo rna una volta entrato nella cellula ospite si duplica sotto forma di dna e si chiama appunto DNA COMPLEMENTARE questo lo può fare solo l’enzima trascrittasi inversa presente nei retrovirus e quindi viene iniettato insieme all’rna all’interno della cellula ospite. Per cui noi possiamo duplicare l’unico filamento dell’rna messaggero grazie alla trascrittasi inversa e avremo un filamento complementare all’rna, ma è un filamento di dna in cui c’è la timina e questo filamento di dna prende il nome di cDNA. Poi i due filamenti di separano e il filamento di cDNA viene fatto duplicare dalla dna polimerasi per ottenere un doppio filamento di dna normale e quindi un pezzo di dna normale. Poi si taglia questo dna normale con gli enzimi di restrizione e si fa lo stesso procedimento di prima per ottenere una genoteca.

Questa genoteca è diversa è migliore della prima poiché mentre la prima contiene tutto il dna di una cellula, quindi sia il dna che codifica per le proteine sia il dna che non codifica per le proteine, la seconda genoteca è migliore poiché contiene solo i geni codificanti perché l’rna messaggero negli eucarioti prima di passare nel citoplasma subisce lo splicing nel senso che vengono eliminati gli introni ovvero i pezzi di dna che non codificano le proteine e rimangono quindi solo gli esoni. Per cui una genoteca composta solo da cDNA è una genoteca in cui ci sono solo i geni codificanti cioè importanti per le proteine. A cosa serve une genoteca? Se so che nel genoma umano c’è un gene che produce una determinata proteina A e so che quel gene ce l’ha anche l’Escherichia Coli quindi devo studiare quel gene e devo vedere se qualche mutazione può generare una malattia. Devo quindi isolare quel gene e studiarlo e allora poiché nella provetta, nella genoteca ho tutto il genoma dell’ Escherichia Coli prenderò il gene dell’escherichia coli in quella genoteca, lo isolo e in laboratorio studio la sequenza nucleotidica, ma quel gene nella provetta deve essere isolato e come faccio? Si interviene con l’uso di una sonda radioattiva SONDA A DNA Come individuo in una genoteca fra tutte le migliaia di molecole ricombinanti o cloni che la compongono quella contenente il gene d’interesse. Si usa il metodo SCREENING (setaccio o selezione) e si basa sulla conoscenza di una parte della sequenza di nucleotidi del gene che io cerco. Uso allora delle molecole marcate con sostanze radioattive o fluorescenti. Costruiamo quindi in laboratorio un frammento di dna corto che è complementare alla sequenza nucleotidica che io conosco del gene ricercato. Questa sonda che costruisco il laboratorio si chiama SONDA OLIGONUCLEOTIDICA è costituita da sequenza radioattive costruite in laboratorio in modo complementare a un tratto del gene d’interesse. Per cui nella provetta inserisco questa sonda oligonucleotidica e faccio avvenire l’IBRIDAZIONE  il dna all’interno della provetta si apre, si rompono i legami a idrogeno e si separano quindi i due filamenti e la mia sonda si lega con il filamento complementare del gene d’interesse e me lo rende visibile poiché radioattiva e si lega per ibridazione al gene d’interesse e riesco così a isolare i cloni che contengono il gene d’interesse. PROGETTO GENOMA UMANO Nel 1990 il genetista statunitense Watson diede inizio ad un ambizioso progetto PROGETTO GENOMA UMANO o HGP. Questo progetto ha permesso di codificare la sequenza completa dei nucleotidi che compongono il dna umano. Questo progetto serviva a sequenziare (conoscere perfettamente la sequenza dei nucleotidi del dna). Il genoma umano è composto da oltre 3 miliardi di coppie di basi azotate e se la sequenza nucleotidica di tutto il dna nel nucleo della cellula umana venisse stampata occuperebbe una pila di libri alta 18 piani. Questo progetto iniziato nel 1990 ha coinvolto i laboratori di 50 paesi tra cui anche l’Italia che ha partecipato con lo scienziato (premio Nobel) RENATO DULBECCO. L’obiettivo era rendere disponibile tutti i dati mediante la creazione di una banca dati disponibile liberamente per tutta la comunità scientifica. Il tutto era finanziato dagli stati che partecipavano. Poi nel 1998 entrò in gioco una società privato: la CELERA GENOMICS di VENTER. Ma lui voleva raggiungere lo stesso obiettivo prima degli altri per poter sfruttare i dati raccolti. Fu proprio VENTER ad annunciare nel 2001 il sequenziamento del 98% del dna umano , mentre tutti l’associazione di tutti gli altri stati completò l’opera solo nel 2003, comunque in anticipo rispetto a quanto programmato. Nel 2006, il 17 maggio, viene resa pubblica la sequenza dell’ultimo cromosoma. Il cromosoma numero 1 che è il più lungo

e il più difficile da sequenziare. Sia VENTER che gli altri scienziati raggiunsero risultati simili con scoperte importanti: 1) Si scoprì che la specie umana non possiede 100 000 geni come si credeva, ma ne possiede 25 000 e sono questi ad essere codificanti per le proteine, per il trna, per l’rna e così via. Anche se è un essere superiore rispetto a tanti esseri viventi la specie umana ha un numero di geni codificanti simili ad un verme, un nematode. Si è quindi arrivati alla conclusione che la complessità delle forme di vita non dipende dal numero dei geni, ma dal modo in cui la loro espressione viene regolata. Quindi è importante come i geni vengono regolati: un gene regola più proteine poiché negli eucarioti abbiamo lo splicing alternativo. 2) Si scoprì anche che una grande quantità di DNA nell’uomo non serve a codificare le proteine, precisamente il 97%. Questo dna è stato conservato nel corso dell’evoluzione della nostra specie, e quindi ha altre funzioni: -ci sono sequenze regolatrici come i promotori, le enhancer -ci sono introni, sequenze intergeniche - sequenze ripetute nei contromeri (punto in cui i cromatidi si uniscono) e nei telomeri (estremità dei cromatidi) - trasposoni ovvero geni mobili in grado di moltiplicarsi e trasferirsi nei vari punti del genoma. Tutto questo dna che ha altre funzioni in passato si pensava che non servisse a niente e venne chiamato DNA SPAZZATURA o JUNK DNA. Adesso invece si ritiene che sia un dna molto importante e che abbia anche una funzione di regolazione nella comparsa delle mutazioni. Una volta determinata la sequenza del genoma umano, la ricerca si è orientata verso la mappatura dei geni sui cromosomi quindi scoprire in che punto si trovano nel cromosoma. Si possono identificare i geni mutati negli organismi affetti da una malattia ereditaria come è successo per il morbo di Parkinson risalendo dalle proteine alterate ai geni. Il dna isolato e identificato e sequenziato da Venter proveniva da lui, invece il genoma sequenziato dagli altri scienziati proveniva da un gruppo di persone diverse....