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TOMA DE MUESTRAS PARA LEPRA

AGENTE ETIOLÓGICO: Mycobacterium leprae, bacilo ácido-alcohol resistente conocido como bacilo de Hansen, es intracelular obligado, no cultivable que se multiplica principalmente en el interior de los macrófagos de la piel (histiocitos), de los nervios periféricos (células de Schwann) y en el sistema retículo endotelial.

TRANSMISIÓN: Se da en forma directa, por inhalación de secreciones del tracto respiratorio superior (nariz y boca), derivada de la convivencia prolongada de una persona con un grado de inmunodepresión con un enfermo no tratado.

iNCUBACIÓN: Varía de 9 meses a 10 años

El caso deja de ser infectante a los tres meses de tratamiento continuo y regular con dapsona o clofazimina y a los tres días de tratamiento con rifampicina.

Los factores de riesgo asociados con la presencia de un caso nuevo de lepra son desnutrición, hacinamiento y susceptibilidad inmunológica.

La vacunación con BCG es efectiva en la protección frente a la lepra hasta en un 70%, siendo más efectiva con pautas de administración repetidas.

TOMA DE MUESTRAS

Personas que presenten algunas de las siguientes manifestaciones clínicas:

Sintomáticos de piel (SP) persona con cualquier tipo de lesión cutánea, anestésicas o hipoestésicas, hipopigmentadas o rojizas, bien delimitadas o con bordes difusos, no congénita, diferente a cicatriz, sea o no su motivo de consulta, de larga duración y que no haya respondido a tratamientos previos.

Sintomático de sistema nervioso periférico (SSNP) personas con áreas corporales hipo o anestésicas, o con problemas motores distales de las manos, los pies o los párpados.

Toda persona que presente una o más de las siguientes señales: manchas hipocrómicas o eritemato-hipocrómicas, con o sin disminución de la sudoración y con o sin alopecia localizada, con alteración de la sensibilidad, áreas cutáneas con anestesia, hipoestesia o parestesias, placas eritematosas de límites nítidos con alteración de la sensibilidad; lesiones eritematosas planas con centro claro o placas infiltradas, con alteración de la sensibilidad, placas eritematosas infiltradas de bordes difusos, con alteración de la sensibilidad, tubérculos y nódulos, pérdida extensa de sensibilidad en las manos o en los pies, uno o más troncos nerviosos periféricos engrosados, con pérdida de la sensibilidad y de la motricidad en su distribución correspondiente, sin lesiones cutáneas; nervios dolorosos espontáneamente o a la palpación; úlceras indoloras en las manos o en los pies.

Al Sivigila se notifican los casos NUEVOS, RECIDIVAS y REINGRESO POR ABANDONO RECUPERADO, de lepra confirmadas; la notificación se realiza de manera semanal y obligatoria.

El diagnóstico es principalmente clínico.

El análisis de laboratorio se utiliza para clasificar la enfermedad en paucibacilar o multibacilar, también para monitorear el tratamiento; es decir cuando la presencia de bacilos BAAR es negativa.

Multibacilar: Presencia y visualización de grandes cantidades de BAAR en tejido La lepra multibacilar2 se produce cuando la inmunidad celular es deficiente en general. Las lesiones cutáneas rugosas y nodulares se deben a la infiltración de la dermis por macrófagos deficientes cargados de M. leprae. También son comunes las lesiones nerviosas que, si no se tratan, pueden originar deformaciones incapacitantes. Estas lesiones se perpetúan principalmente durante las exacerbaciones inflamatorias de base inmunológica, que son de dos tipos: • Tipo I (reacciones de inversión), debido a un proceso de inmunidad celular y caracterizado por una exacerbación aguda de las lesiones cutáneas y por crisis focales o más generalizadas de neuritis, que a veces dan lugar a lesiones nerviosas permanentes.

• Tipo II (eritema nudoso leproso), debido a una reacción de complejos inmunitarios y caracterizado por una respuesta de anticuerpos. En la piel se producen lesiones inflamatorias agudas dispersas. Los síntomas generales, cuando aparecen, comprenden fiebre, linfadenopatía, iridociclitis aguda y, con menos frecuencia, neuritis, poliartritis y glomerulonefritis. 2

Comprende: lepra lepromatosa y borderline (clasificación de Madrid); lepra lepromatosa polar,

lepromatosa borderline y semiborderline (clasificación de Ridley y Jopling); y los casos con frotis positivo en los demás tipos de lepra.

Paucibacilar: no se visualiza presencia de BAAR pero se sabe que están allí por las señales de destrucción a tejidos La lepra paucibacilar1 se produce cuando la inmunidad celular sólo es deficiente en parte. En los frotis cutáneos se observan relativamente pocos bacilos. Las lesiones granulomatosas en la dermis, que en ocasiones sanan espontáneamente, se presentan en forma de manchas hipopigmentadas e hipoestéticas o anestésicas. La afectación de nervios periféricos puede limitarse a causar pérdidas localizadas y leves de la sensibilidad pero, en los casos graves, la pérdida sensomotora es extensa y provoca alteraciones tróficas, atrofia muscular y contracturas. 1

Comprende: lepra indeterminada y tuberculoide con frotis negativo (clasificación de Madrid); lepra

indeterminada, tuberculoide polar y tuberculoide borderline con frotis negativos (clasificación de Ridley y Jopling). Las pérdidas de visión o la ceguera son frecuentes tanto en la lepra paucibacilar como en la multibacilar. Pueden deberse a infiltración micobacteriana e inflamación de las estructuras del segmento anterior del ojo, o bien a cambios tróficos originados por lesión de los nervios trigémino y facial, que dan lugar a lagoftalmos, deformación de los párpados o anestesia corneal.

ACCIONES DE LABORATORIO:

La baciloscopia se utiliza para la clasificación de todos los casos de Hansen, de acuerdo a la clasificación del caso se debe realizar el control de tratamiento, se define como el examen directo de material extraído de líquido intersticial o piel, que se tiñe por la técnica de Ziehl Neelsen con el fin de visualizar bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR), aprovechando esta propiedad de las Micobacterias y por tanto de Mycobcterium leprae.

Si al examen clínico se tiene como impresión diagnostica lepra, se debe proceder a la toma de la muestra de líquido intersticial rico en macrófagos, que contienen los bacilos, para realizar la baciloscopia con el fin de clasificar el caso, si el resultado del examen evidencia la presencia de BAAR (índice bacilar >0) el caso es Multibacilar (MB) o si no se evidencian BAAR (índice bacilar =0) el caso es Paucibacilar (PB). Una baciloscopia con índice bacilar igual a cero (0) no descarta que el caso sea multibacilar, para lograr discriminarlo se debe realizar una

biopsia de piel.

1.

Para obtener una buena muestra es indispensable dejar completamente exangüe (libre de sangre) el sitio donde va a recolectarse el líquido intersticial, esto se logra empleando pinzas tipo Kelly sin garra hemostáticas. Para lograr una mejor isquemia frote el sitio utilizando un escobillón seco, siempre en una misma dirección, hasta que la zona esté completamente pálida garantizando la ausencia de sangre.

2. La solicitud del examen debe llegar al laboratorio con un esquema corporal en el cual el médico identifica la localización de las lesiones, esto facilita que el personal del laboratorio pueda recolectar las muestras de linfa de los sitios donde hay manifestaciones clínicas del bacilo. 3. La forma correcta de hacer el proceso es recolectando seis muestras dentro de las que se encuentran lóbulos de las orejas, lesiones y/o codos. 4. Los frotis se recolectan en una misma lámina y deben ser coloreados inmediatamente mediante la técnica de Ziehl Neelsen (ZN); la lectura se realiza e informa teniendo en cuenta las muestras recolectadas y la metodología de lectura según corresponda (escala semicuantitativa, escala de Ridley), para los dos casos es necesario calcular el Índice Bacilar.

El seguimiento del tratamiento de los casos de Hansen por laboratorio se realiza teniendo en cuenta la clasificación inicial , si fue PB se debe realizar una baciloscopia al finalizar el tratamiento que para este caso se esperaría que su índice bacilar siga siendo =0, para los casos MB se realiza semestralmente durante el tiempo que dure el tratamiento y al finalizar el mismo, con esto se busca hacer seguimiento a la efectividad del tratamiento que se debe ver evidenciada con la reducción del IB entre el momento del diagnóstico y el control, en aquellos casos en que no existe mejoría clínica y el IB prácticamente se mantenga, se recomienda hacer la lectura del índice morfológico, este es un proceso que requiere ser realizado por personal con mucha experticia y experiencia en la diferenciación de bacilos y conocimiento de su morfología durante las fases del tratamiento, este es el porcentaje de bacilos sólidos respecto al total de BAAR encontrados al observar 100 bacilos aislados, la metodología implica una revisión detallada de las estructuras bacilares, se debe realizar en laboratorios con experticia certificada y debe ser interpretado por un clínico experto en manejo de casos de Hansen.

OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS Los portaobjetos nuevos deben ser lavados y desengrasados esto último se logra almacenando las láminas en alcohol/éter, alcohol/acetona o alcohol/ácido antes de su uso, en el momento de utilizar una lámina debe ser lavada y secada. En cada portaobjeto se pueden colocar hasta 6 muestras de un mismo paciente, debidamente rotulados con lápiz de diamante.

BACILOSCOPIA DE PIEL: Se dará preferencia a las lesiones recientes, razón por la cual es conveniente interrogar al enfermo sobre este aspecto. En toda lesión circunscripta el corte se realizará en el borde activo de la lesión. Si la misma tuviera una zona central sana (Iesiones en escarapela) se elegirá entre el borde interno y el externo aquel que presente un aspecto más difuso. Si el paciente no presenta lesiones activas en el momento del examen, se pueden efectuar incisiones en los lóbulos de las orejas y codos.

Obtención de linfa de los lóbulos de las orejas y codos: Antes de realizar la incisión para la obtención de linfa, se debe efectuar una meticulosa desinfección de la piel con alcohol etílico 70%. Una vez seca la zona, se pinzará con una pinza preparada para ello comprimir el tejido para anemizarlo. Manteniendo la presión, se realiza un corte de aproximadamente 5 mm de longitud y 2 ó 3 mm de profundidad, con un bisturí de hoja desechable pequeña No. 15. Una vez efectuada la incisión se raspan los bordes internos de la misma con la punta del bisturí colocado transversalmente al corte, para que fluya la linfa con el tegumento y con el borde no filoso con un rápido movimiento se recoge el material que inmediatamente se extiende con el mismo instrumento dentro del círculo en el portaobjeto, la linfa se distribuye uniformemente en un área de 6 ó 7 mm de diámetro, mediante movimientos circulares suaves.

BACILOSCOPÍA DE MUCUS NASAL: Los bacilos de Hansen generalmente no se encuentran en el mucus nasal si están ausentes en las lesiones cutánea, y cuando comienza el tratamiento, el frotis de mucus nasal se negativiza antes que el de las lesiones tegumentarias, por ello no se realiza cuando el paciente ya está bajo tratamiento. Técnica para obtención: esta es la técnica más simple, permite recolectar abundante material, útil en casos de secreciones escasas o muy secas. Se emplea un hisopo estéril humedecido en solución fisiológica, estéril, con él que se realiza el raspado de ambas caras del tabique nasal. Se frota el hisopo sobre un portaobjetos para depositar el material obtenido, siempre formando un círculo de 6 ó 7 milímetros de diámetro.

Imágenes:

Extensión de los frotis

si no hay lesión entonces se toma linfa de codo la cual se distribuye en el mismo orden que la lesión.

Procesamiento de muestra:

FIJADO Una vez realizados los frotis, se dejan secar al aire y luego se fijan pasando los portaobjetos (sostenido con la mano) sobre una llama débil, de modo que se caliente el lado contrario al que contiene las muestras. El flameando no debe ser excesivo, ya que puede interferir la coloración. Tres o cuatro pasajes sobre la llama son suficientes.

COLORACIÓN: el mecanismo de ácido alcohol resistencia es una propiedad que tiene las micobacterias de captar en su pared la fucsina fenicada y retenerla aún con la acción del alcohol ácido, esta característica se debe al alto contenido de lípidos, péptidos, glicolípidos y especialmente de los ácidos micólicos en la pared celular. El papel de la solución fenolada que es el mordiente es fomentar la penetración de la fucsina y su unión con los lípidos bacilares haciéndola más liposoluble y menos hidrosoluble.

● Los frotis se cubren con una solución al 1% de fucsina fenicada filtrada, se flamea evitando la formación de vapores y que la coloración hierva (se genera destrucción de la pared de los bacilos), esto se hace por 10 minutos, se lavan con abundante agua corriente y se escurre. ● Se cubren con una mezcla de ácido clorhídrico al 1% en etanol al 96% ( alcohol-ácido al 3%) que se deja actuar un minuto y lavar con agua, si aun se observa rojo el extendido repetir el proceso hasta la decoloración ● cubrir con solución acuosa de azul de metileno al 1% y se deja actuar durante 2 minutos , se lava con abundante agua, se retiran los excesos que hallan por debajo de la lámina y se deja secar al aire libre.

ESCALA SEMICUANTITATIVA E ÍNDICE BACILAR

(-): no se encuentran BAAR Número de bacilos: 1 a 9 BAAR en 100 campos observados microscópicos en 10 minutos (+): En promedio, menos de un BAAR por campo, en 100 campos observados (++): Uno a diez BAAR por campo, en 50 campos observados (+++): Se observan más de diez BAAR, por campo en 20 campos observados

Para el índice bailar se debe clasificar cada muestra en esta escala:

Ejemplo:

Moco: (++) Linfa de oreja izquierda: (++) Linfa de oreja derecha: (++)

Linfa de lesión izquierda: (+) Linfa de lesión derecha: (+)

IB= sumatoria de las cruces de las lesiones/No de muestras IB= 2+2+2+1+1=8/5=1,6 IB= Mayor a 0 es multibacilar IB= Igual a 0 o menor es paucibacilar

ESCALA DE RIDLEY

Se utiliza la escala logarítmica de Ridley, que va del 0 al 6+, que se basa en el promedio de bacilos observados en el frotis, contando los sólidos, los fragmentados y los granulados. Indice:

0 No se encuentra ningún bacilo en 100 campos observados con objetivo de inmersión (1000 X), Debe examinarse 100 campos horizontales y 100 verticales como mínimo.

1+ Se visualiza un promedio de 1 a 10 bacilos en 100 campos observados con objetivo de inmersión (1000 X). Deben examinarse 100 campos como mínimo.

2+ Se visualiza un promedio de 1 a 10 bacilos cada 10 campos observados con objetivo de inmersión (1000 X). Deben examinarse 100 campos como mínimo.

3+ Se visualiza un promedio de 1 a 10 bacilos por campo observados con objetivo de inmersión (1000 X). Deben examinarse 25 campos como mínimo.

4+ Se visualiza un promedio de 10 a 100 bacilos por campo observados con objetivo de inmersión (1000 X). Deben examinarse 25 campos como mínimo. Pueden observarse globis a partir de esta codificación

5+ Se visualiza un promedio de 100 a 1000 bacilos por campo observados con objetivo de inmersión (1000 X). Deben examinarse 25 campos como mínimo.

6+ Se visualiza un promedio de más de 1000 bacilos por campo observados con objetivo de inmersión n (1000 X). Deben examinarse 25 campos como mínimo....