Les Lymphocytes T gamma delta PDF

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Dr Chretien ...

Description

Bases moléculaires des biothérapies : les lymphocytes T yd : Fonctions, ligands et applications en immunothérapie

Ont des fonctions intéressantes en termes de ciblages de cellules tumorales.

I-

Introduction A- Caractéristiques de lymphocytes T γδ



Présentent des propriétés à la fois de l’II et l’IA.

L’II : cellules servent de première ligne de défense contre agressions de pathogènes : macrophages, cellules dendritiques, le complément, NK, les granulocytes. L’IA se met en place dans un second temps. Est dépendante de la présentation antigénique, permet de générer une mémoire immunitaire et une réaction immunitaire plus importante lors de la seconde exposition à l’antigène. Les lymphocytes T γδ présentent à la fois les caractéristiques l’II et de l’IA : -

Génération de cellules mémoires

-

Partagent un certain nb de R avec cellules NK qui pourront s’activer spontanément et facilement face à une cible (comme les cellules NK peuvent le faire)



Phénotypes de ces lymphocytes T γδ

Sont des lymphocytes T : -

CD3+

-

CD4-

-

CD8-

-

Caractérisé par l’expression d’un TCR particulier : le TCR γδ (par opposition au TCR αβ portés par les LT CD4 et CD8) et du R NKG2D

Sont composés d’un TCR composé deux chaines : gamma et delta. Fréquence beaucoup plus faible que les LT αβ dans le sang périphérique : 2% dans le sang chez le sujet sain. Se multiplie rapidement lors d’infections virales ou parasitaire, 10 à 15% lors d’infections grippales par exemple. Fréquence élevée dans les tissus, notamment dans la muqueuse intestinale. Deux types de lymphocytes T γδ avec des localisations tissulaires différentes : -

Les LT γδ Vδ2 +

-

LT γδ Vδ2 – Page 1 sur 11

Vg5Vd1 => peau / Vg6Vd1 => muqueuse / Vg9Vd4 => intestin / Vg4Vd6 => organes lymphoïdes et poumons / Vg9Vd2 => sang périphérique. Sont des lymphocytes très conservés au cours de l’évolution  sont donc très utiles. Tous les vertébrés en possèdent. Seuls les primates ont une population sanguine exprimant le R de type TCR Vy9Vd2. Etudié par cytométrie en flux : seront CD3+ et Vd2+. Sont donc situés en haut à droite du diagramme.

Les γδ Vδ2 Moins bien caractérisés que les γδ Vδ2 + car ils ne sont pas dans le sang circulant donc prélèvement tissulaire obligatoire pour les étudier (prélèvement tissulaire = plus compliqué à effectuer). Cela explique que les + soient mieux caractérisés. Expansion dans divers contextes infectieux impliquant des bactéries intracellulaires (Mycobacteria / Listeria), bactéries extracellulaires (Borrelia burgdorferi), virus (VIH et CMV). Le contact des LT avec ces agents infectieux engendre leur expansion en quantité importante. Deviendra majoritaire (plus importante que les LT CD4 et CD8).

Caractéristiques générales (centrées sur les +) Concernant les ag reconnus par ces LT yd : les réponses ne sont pas bloquées par des AC dirigés contre les molécules du CMH : leur activation est CMH indépendante. Est aussi le cas des LT yd +. Par exemple un LT CD8 ne pourra attaquer spontanément un pathogène. L’antigène est apprêté par la CPA et présenté aux lymphocytes. Infection  cellules phagocytaires capturent antigènes (deviennent alors des CPA)  présentent les antigènes au niveau lymphatique  activation des LT. La présentation antigénique se fait via le CMH I ou II. Le LT yd n’a pas besoin de toute cette étape de présentation antigénique pour être activé. La réponse est spontanée (come dans le cas de l’II) et sera plus rapide. Des antigènes (normalement lipide, protéine ou sucre) particuliers sont reconnus par les LT yd, notamment des phosphoantigènes. Leur fréquence augmente pendant infections : tuberculose, méningite, parasitose type toxoplasme ou leishmaniose … Fréquence augmente dans les TIL (tumor infiltrating lymphocytes) : on trouve ces LT dans le tissu tumoral. 

In vitro

-

Tuent des cellules infectées par des bactéries, protozoaires et virus

-

Tuent diverses lignées tumorales hématopoïétiques (type leucémie)

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NB : observation de certains signes cliniques infectieux chez patient avec une augmentation systématique des LTyd  il s’agit seulement d’une corrélation (les LT n’ont pas forcément de rôle dans l’infection)  il faut démontrer leur rôle suspecté (in vitro, modèles animaux…). Pour ensuite dire si ça peut être une cible utile en thérapeutique.

B- Les ligands des lymphocytes T gd (phosphoantigènes) Ces LT exercent leur fonction (tuer les pathogènes) grâce à la reconnaissance des phosphoantigènes (PA) : ag phosphorylée. Trois sont à retenir : IPP – DMAPP – BrHPP. IPP est synthétisé par la cellule tumorale. DMAPP par le corps humain et le BrHPP est un phosphoantigène synthétique. Bioactivité : pour activer un LT yd j’ai besoin de 50 um de Ethyl-PP et 3 pour un IPP. L’activité est donc croissante du H DMAPP à l’Ethyl-PP.

Les PA sont produits par la cellule par deux grandes voies métaboliques : -

Voie mévalonate (voie de biosynthèse du cholestérol)

-

Voie non-mévalonate (permet la biosynthèse de métabolites et nécessaire à la survie bactérienne), un des intermédiaires de synthèse est le HDMAPP.

Une cellule bactérienne accumule beaucoup de HDMAPP. Cellule tumorale : suractivation de la voie mévalonate  cumule de l’IPP. Dans les deux cas il y a accumulation d’antigènes reconnus par LT yd. Cela enclenche le signal d’activation des LT yd. Les LT yd sont les seules cellules connues pour reconnaitre des PA.

DIFFERENCIATION des LYMPHOCYTES T gd Vd2+ -

LT yd NAIFS : pool de cellules naïves au niveau des ganglions caractérisées par la double expression de CD45RA et CD27

-

Perdent progressivement l’expression CD45RA

-

Deviennent cellules centrales mémoires

-

Puis se divisent encore en LT effecteurs mémoire Temh1 ou TemRA (réacquièrent le CD45RA). « Tem » pour T effecteurs mémoire. Temh1 : impliqués dans la sécrétion de cytokines .TemRA : sont directement cytotoxiques

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C- Fonctions des LTyd Vd2 + 1- Cytotoxicité directe Avec de la thrombocytose. Les LT rencontrent cellules infectée ou tumorale et la lyse. 2- Sécrétion de cytokines, chemokines (TNFa, INFg, IL6, MIP1b…) Les cytokines permettent de recruter d’autres cellules immunitaires. 3- Stimulation cellules dendritiques ou T cell (via cytokines notamment) pour amplifier la lyse des cellules infectées ou tumorales 4- Expansion Les LT sécrètent IL2 et ont un R à l’IL2  vont pouvoir s’autostimuler : en présence d’IL2 les LTyd s’expandent énormément. En culture si on met des millions de LT yd avec de l’IL2 on obtient des milliards de LTyd au bout de deux semaines de culture. Intéressant car si on veut les utiliser en tant qu’agent de thérapie antitumorale il faut les amplifier car ne représentent que 2% de la population lymphocytaire de base.

Fonction 1: La trogocytose (thrombocytose) = reflet du contact cellulaire Target cible marquée (cellule tumorale ou infectée) avec le PKH-7 (marqueur membranaire  membrane verte) en culture avec LTyd (ou conventionnels car peuvent aussi faire thrombocytose)  au bout de 60 minutes la fluorescence est retrouvée au niveau des LT : des petits morceaux de membrane se sont fait arrachés par LTyd au moment de la formation de la synapse (le relargage de produits cytotoxiques (granzymes, perforine…) pour tuer cellules cibles par les LT nécessite la formation de cette synapse avec la cellule cible). Aussi les LT arrache bout de membrane à la cellule cible ce qui permet d’augmenter le temps d’activation des LT.

La cytométrie en flux permet d’analyse cette thrombocytose : les cellules passent une par une par tubulure, elles vont être emportées par un liquide. Les cellules passent devant plusieurs lasers qui vont exciter mol fluorescentes et des détecteurs vont détecter un signal fluorescent. Une cellule non marquée (n’a pas fait la thrombocytose)  il n’y a aucun fluorochrome à exciter : pas de signal lumineux transmis au détecteur. Si la thrombocytose a été effectuée par la cellule : on récupère un signal lumineux. Très puissant : les cellules vont jusqu’à 2000 par seconde. Au bout d’une minute on teste plusieurs 100aine de milliers de cellules (pour chacune on a la quantifier la fluorescence). Permet de faire mesure à l’échelle d’une seule cellule : très précis.

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Puis analyse des résultats En Y : TCRVy0 – En X : fluorescence du PKH67. A gauche on observe les cellules négatives et les cellules positives à droite. A TO aucune fluorescence. Au bout de 60 min augmentation de la fluorescence  les cellules yd négatives deviennent positives en présence de cellules cibles (lymphomes, tumeurs maligne…). Donc augmentation de la fluorescence (donc thrombocytose) dans les trois cas présentés.

Visualisation de la lyse des cellules dendritiques infectées par le BCG par des LTyd. En vert marqueur de la viabilité : cellule verte vivante – gris morte. Les LTyd migrent vers la cellule infectée  formation de la synapse  sécrétion de granules contenant perforine, granzymes …  mort de la cellule infectée au bout de 52 min.

Même chose avec une cellule tumorale vivante mise en présence de LTyd. LTyd marqué par un lysotrackeur : permet de visualiser en rouge les granules de perforines (permettent de perforer membrane de la cellule cible). Membrane tracker en bleu et marqueur de viabilité (calcéine) en vert. Cellule yd reconnait cible  création de la synapse bleu = thrombocytose, la cellule tumorale est morte. En même temps que le vert disparait de la cellule cible il y a apparition du bleu dans le LT yd : mort de la cellule tumorale et le bleu marque la thrombocytose.

Mécanismes d’activation des LT yd 

Sécrétion de PA reconnu par le TCR du LTyd  activation du LTyd.



Expression de protéines (MIC A/B et les ULBPs) à la surface de cellules infectées ou tumorales qui sont des ligands du R NKG2D présent sur LT yd  intéraction ligand/R  activation du LTyd.

À la suite de l’activation : 

Sécrétion de granzymes, perforines, cytokines (recrutement d’autre cellules immunitaires).



Mise en jeu du ligand FasL qui va induire l’apoptose de la cellule tumorale à la suite de la liaison à son R Fas.



Mécanisme ADCC : cytotoxicité médiée par les AC. AC dirigé vers une protéine à la surface d’une cellule tumorale (EGFR par exemple)  injection d’un AC anti EGFR : éteint tout une voie de signalisation à l’intérieur de la cellule + autre mécanisme mise en jeu : la partie Fc de l’AC est reconnu par le Fc receptor des LT yd  mort de la cellule tumorale. Ce R est aussi trouvé sur les cellules NK.

Fonction 4 : expansion in vitro Page 5 sur 11

LTyd se divisent ++ rapidement  comment suivre leur prolifération ? 1- Isolement et culture : milieu de culture avec IL2 par exemple (plus ajout d’un PA si on veut accentuer la prolifération)  récolte de milliards de cellules  compte au microscope (pas précis) 2- Marquer cellules avec du CFSE (colorant fluorescent qui est un marqueur de la fluorescent) qu’on incube avec les LT  à chaque division le CFSE se dilue : il y a de moins en moins de CFSE dans les cellules au fil des divisions cellulaires. 3- Observation des cellules en cytométrie de flux : -

A J0 il n’y a aucune division, les cellules sont toute vertes foncées. L’intensité de l’expression du CFSE est forte.

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A J4 le signal est encore fort, les cellules ne se sont pas encore divisées.

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A partir de J5 on observe plusieurs pics : la moitié des cellules sont situées sur la droite du graph  se sont divisées. Ici les cellules se sont divisées une seule fois.

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A J6 les cellules se sont divisées 4 fois : les pics sont représentatifs du nombre de divisions.

Fonction 4 : expansion in vivo In vivo la prolifération est-elle également stimulable ? IL2 seul ne permet pas l’amplification des yd in vivo, cette amplification est dépendante d’un PA : IPH1101 (PA de synthèse). Injection de IL2 seul ou IL2 + PA chez le primate puis mesure des LT yd à J7. Plus on injecte de PA IPH1101 plus il y a de prolifération des LT yd. Les yd Vd2 sont présents seulement chez primates donc étude réalisée sur primates. Si on veut le faire étude sur souris : modification génétique ou injection de LTyd humain. Cytométrie en flux : après injection de IL2 + PA après 7 jours on passe de 4% à 79.5% de LT yd Vd2.

II-

Applications thérapeutiques Page 6 sur 11

A- Exemples de choix d’indications en oncologie 1- Le cancer du rein métastatique : essais pré-cliniques et cliniques Quantification de la capacité de lyse des LT yd. Plusieurs méthodes permettent de quantifier la capacité de lyse des LTyd. On met en culture les LT yd en présence de : -

Daudi : cellules qui n’ont pas de beta 2 microglobuline et qui seront donc spontanément et rapidement lysées par les yd  servent de contrôle positif. Par exemple si les résultats pour Raji, normal and tumor cells soient tous à zéro on sait que l’on a bien réalisé la manipulation et que l’on n’a rien oublié (oublie d’ajouter IL2 par exemple).

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Raji : lignée tumorale

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Cellules normales

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Cellules tumorales

Principe du test : des cellules tumorales sont marquées avec du Cr51 radioactif  culture dans un puit  au bout de 4h observation : -

Cellules tumorales seules (=témoin négatif) : libération d’un petit peu de Cr dans le milieu.

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1 yd pour 1 cellule tumorale (=ration effecteur cible) : les LT yd vont lyser quelques cellules  légère augmentation du relargage du Cr51.

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10 yd pour 1 cellule tumorale : encore plus de cellules tumorales lysées et encore plus de chrome.

-

30 yd pour 1 ct : tout est lysé et milieu ++ riche en Cr51.

La quantité de radioactivité libérée dans le milieu est proportionnelle à l’efficacité de lyse des tumeurs. Pourquoi ne pas juste compter les tumor cells avant et après à la place d’utiliser toute cette technique ? La cellule tumorale se divise rapidement et plus la cellule est représentative d’un cancer agressif alors elle se divise rapidement et moins on mesure correctement la capacité de lyse. La radioactivité fait partit des meilleures méthodes d’évaluation de la capacité de lyse par les LT yd. Ok mais cela fonctionne-t-il in vivo chez l’animal ou chez l’homme ?

Il y a un rationnel à vouloir amplifier ces cellules chez les cancéreux. Coupes en histochimie de tumeurs des tubes rénaux : -

En haut marquage CD3

-

En bas marquage TCR

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Ces cellules sont déjà présente sur le site tumoral : dans la tumeur ces cellules sont là et in vitro on sait qu’elles lysent les cellules tumorales donc si on peut arriver à les amplifier in vivo ça peut être intéressant.  Réalisation de tests chez les animaux. Souris greffées par cellules cancéreuse du rein humaine  2 à 3 semaines : tumeur de 50mm3  on stimule prolifération des yd en injectant IL2 et PA (IPH1101) + injection de LTyd humains. Suivi de l’efficacité du traitement par suivi du volume tumoral et prolifération et migration des yd dans la tumeur. -

En y volume tumoral mesuré tous les 7j

Condition contrôle sans PBMC (cellules périphériques sanguines mononuclées) cf. on a pris la totalité des GB chez homme puis injection à la souris, on n’a pas isolé juste les yd. -

IL2 seule : baisse de la croissance tumorale

-

IPH et IL-2 : stimule spécifiquement la croissance des LTyd : la tumeur pousse beaucoup moins vite.

A été démontré pour plusieurs lignées différentes.

2- Combinaison avec rituximab dans le lymphome folliculaire Hémopathies malignes de type B : différenciation au niveau de la MO et autres organes lymphatiques des LB  circulation des LB  sécrétion d’AC et infiltration des tissus pour devenir des plasmocytes. A chaque stade de la différenciation des LB des clones vont pouvoir devenir tumoraux. Selon l’étape à laquelle apparaît le clone différents types de pathologies. Par exemple : -

Au niveau des cellule pro B ou B immatures: leucémie aiguë lymphoïde de type B

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Ganglions : lymphomes

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Plasmocytes : multiple myeloma

Possibilité pour traiter lymphomes (LB devenus malins, expriment RCD20) : utilisation du Rituximab qui a divers modes d’action : -

Blocage de l’antigène : AC dirigé contre CD20 (rituximab).

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Complément : le rituximab recrute le complément permet une lyse complémentdépendante de la cellule tumorale.

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Phagocytose : grâce au R Fc et le fragment Fc de l’AC  recrutement de cellules phagocytaires qui reconnaissent cellule recouvert d’Ac et la phagocyte.

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ADCC : Les LTyd reconnaissent le fragment et vont tuer par lyse par granules lytiques les cellules recouvertes d’AC. Cas des cellules NK aussi.

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Pourquoi combiner Rituximab et Phosphoantigène ? Problématique : quelques cellules de B-NHL répondent faiblement au Rituximab Le traitement des FL en rechute requiert encore des améliorations. Pourquoi potentialiser le Rituximab avec les lymphocytes T γδ ? On cible les LTyd pour améliorer les traitements par Rituximab car les LT yd sont de bons réservoirs d’effecteurs cellulaires d’ADCC : ce sont les LTyd qui vont bien exprimer CD16 qui vont pouvoir complémenter l’action du R, s’expandent rapidement, lysent les cellules B tumorales in-vitro. On observe jusqu’à 70% de lyse quand culture de LTyd avec différentes lignées tumorales.

Les résultats de la première immunothérapie de phase I ciblant les cellules T gd avec du pamidronate + IL2 dans le FL et le MM (myélome mutiple) On essaie de cibler les yd avec du pamidronate, est un biphosphonate qui bloque la voie de synthèse du mévalonate juste après la sécrétion de l’IPP ce qui conduit à l’amplification d’IPP dans la cellule tumorale. NB : Concernant la voie du mévalonate il y a deux façons d’augmenter l’IPP dans la cellule : -

Injection de BrHPP

-

Injection de biphosphonate qui bloque la voie de synthèse juste après la sécrétion d’IPP  augmente le signal de danger que va véhiculer la cellule tumorale.

Au total 18 patients dans la phase I : Les 9ers patients ne répondent pas : très problématique  arrêt de l’essai clinique et on change le protocole : on ajoute une étape de présélection des patients. Etape de présélection : prise de sang chez les patients  isolation des LTyd et on regarde in vitro si le duo pamidronate/IL-2 permet l’amplification des yd. On vérifie donc in vitro si le traitement fonctionne sur les cibles. Il se trouve que chez certains patients le traitement in vitro fonctionne pas ou beaucoup moins bien. On administre donc le traitement qu’aux patients pour lesquels on observe in vitro une prolifération des LTyd à la suite à leur mise en présence avec le traitement. En sélectionnant patients on identifie patients qui répondent au traitement. Taux de réponse objective = 60% (3/5). 3/5 patients répondent quand on arrive à faire proliférer les LTyd. Zéro pourcent de réponse quand prolifération de yd non possible. Bons résultats concernant l’efficacité du traitement mais une prédisposition des patients à avoir leur LT yd qui prolifèrent in vitro avec le traitement est requise. Donc bien mais non suffisant.

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Efficacité pré-cliniqu...