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breve documento word sui lisosomi e sulla morte cellulare associata ai lisosomi...

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METODI PER VALUTARE LMP Sono stati sviluppati diversi metodi per rilevare LMP (recensioni in Rif. 5 , 59 Figura 4 ). Uno di questi metodi misura il rilascio nel citosol di enzimi lisosomiali come le catepsine B e D, 60 Figura 4 A. Queste proteine possono essere visualizzate mediante microscopia a fluorescenza. Le catepsine confinate all'interno dei lisosomi intatti sono visualizzate come un pattern puntiforme di intensa fluorescenza e possono essere colorate insieme agli anticorpi contro LAMP-1 o LAMP-2. Al contrario, le catepsine rilasciate durante l'LMP producono un pattern di fluorescenza diffuso in tutta la cellula. 61 Il rilascio citosolico di catepsine può essere rilevato anche mediante Western blot delle frazioni citosoliche dopo il frazionamento cellulare. 39 ,62 Questo metodo può essere utilizzato per stimare l'entità della LMP determinando simultaneamente i livelli di più catepsine di diverse dimensioni nel tempo. 39 In alternativa, le catepsine negli estratti citosolici possono essere rilevate utilizzando substrati specifici della catepsina (ad es. Magic Red) e un lettore di piastre a fluorescenza. La microscopia a fluorescenza può essere utilizzata anche per contare le cellule catepsina-positive nelle sezioni di tessuto. 63 , 64Ci sono alcune limitazioni alla rilevazione delle catepsine citosoliche che vale la pena notare: (1) i metodi utilizzati potrebbero non essere abbastanza sensibili da rilevare il rilascio di quantità molto piccole di catepsine, che possono comunque avviare la morte cellulare e (2) con oltre 50 enzimi lisosomiali descritti fino ad oggi, la selezione di un marcatore a volte può essere difficile. I metodi più comuni rilevano l'espressione delle catepsine B e D.

La destabilizzazione lisosomiale può anche essere monitorata utilizzando destrani fluorescenti in esperimenti di impulso e inseguimento 65 (Figura 4 C). La microscopia a fluorescenza può essere utilizzata per monitorare il rilascio di destrani nel citosol indotto da LMP. L'entità di LMP può essere stimata utilizzando destrani di diverso peso molecolare (10-250 kDa): molecole di destrano FITC più piccole vengono rilasciate in risposta a LMP associata all'apoptosi, mentre molecole di destrano più grandi vengono trattenute. 57 Uno svantaggio di questo metodo è che la normale funzione lisosomiale può essere influenzata dal precarico obbligatorio dei destrani nei lisosomi per endocitosi. Il quarto metodo altamente sensibile per rilevare LMP è il saggio lisosomiale di galectina puncta, 51 Figura 4 D. Come descritto sopra, le galectine citosoliche possono traslocare sulla membrana dei lisosomi che perdono. Le galectine 1 e 3 sono le più appropriate per questo dosaggio: sono ampiamente espresse e rapidamente traslocate; sono inoltre disponibili i corrispondenti anticorpi ad alta affinità. Il dosaggio della galectin puncta è in grado di rilevare l'LMP molto prima dei metodi che monitorano il rilascio di catepsina. 51Ad oggi, questo metodo è l'unico in grado di distinguere il sottoinsieme di lisosomi danneggiati da altri lisosomi intatti all'interno della stessa cellula e ha dimostrato che le cellule possono sopravvivere a LMP interessando un sottoinsieme di lisosomi, che vengono successivamente eliminati dall'autofagia. Il dosaggio galectin puncta può essere adattato per l'uso con piattaforme di imaging ad alta produttività in coniugazione con altri marcatori di vitalità cellulare. 66

Infine, il test ESCRT puncta utilizzato in un recente studio di Skowyra et al è un metodo molto promettente per rilevare piccole rotture della membrana lisosomiale, 47 Figura 4E. Gli autori hanno dimostrato che piccole rotture della membrana lisosomiale consentono la dissipazione del gradiente di pH (permeabile ai protoni), ma non la traslocazione di materiali di peso molecolare più elevato (come le galectine). Caricando gli endolisosomi con destrani ad alto peso molecolare coniugati a FITC sensibile al pH, hanno monitorato l'aumento della fluorescenza, che indica la dissipazione del gradiente di pH nei lisosomi intatti. I risultati dimostrano vividamente che le proteine ESCRT vengono reclutate nei lisosomi danneggiati molto prima delle galectine e che il macchinario ESCRT funziona indipendentemente dalla lisofagi. Oltre a CHMP4A e ALIX (la proteina che interagisce con CHMP4A), sono state reclutate anche altre proteine ESCRT nei lisosomi danneggiati. Come descritto sopra, LMP è un processo altamente dinamico che può attivare più percorsi di risposta allo stress, che generano nuovi lisosomi, riparano lisosomi leggermente danneggiati o eliminano lisosomi drammaticamente danneggiati. L'equilibrio tra la biogenesi dei lisosomi e il riciclaggio determina lo stato lisosomiale in un dato momento. Pertanto, proponiamo che il monitoraggio di LMP nel tempo potrebbe potenzialmente consentire il rilevamento dell'insorgenza e lo sviluppo di LMP e la distinzione tra LMP parziale e totale. L'uso simultaneo di marcatori di permeabilizzazione della membrana esterna mitocondriale (MOMP), destabilizzazione della membrana plasmatica e formazione di autofagosomi potrebbe fornire ulteriori informazioni sul fatto che LMP si verifichi a monte oa valle dello stress cellulare. 51 , 66 , 67Inoltre, gli inibitori della proteasi lisosomiale possono essere utilizzati per determinare se LMP è una causa primaria o secondaria di morte cellulare. In sintesi, si consiglia di utilizzare una varietà di tecniche per monitorare l'LMP nel tempo, in combinazione con marcatori di altri organelli cellulari e percorsi che possono essere influenzati dallo stress lisosomiale.

5 LDCD: MECCANISMO ED ESEMPI Il ruolo dei lisosomi nella morte cellulare programmata è stato riconosciuto per la prima volta oltre 50 anni fa, quando sono stati fatti i primi tentativi di definire e classificare i diversi tipi di morte cellulare. 3 , 68 Questi studi iniziali si sono concentrati sullo sviluppo embrionale e perinatale e per molti anni la definizione di morte cellulare si è basata su criteri morfologici. La morte cellulare dello sviluppo è stata classificata in tre categorie, in base alle caratteristiche morfologiche e al ruolo dei lisosomi nella morte cellulare. La morte cellulare o apoptosi di tipo I è stata caratterizzata dal restringimento e dalla frammentazione della cellula in piccoli corpi, che sono stati successivamente inghiottiti dalle cellule vicine e degradati all'interno dei lisosomi della cellula inglobante 3 , 68; il tipo II o morte cellulare autofagica era caratterizzato dalla formazione di vacuoli autofagici (ora noti come autofagosomi) nelle cellule morenti; e la necrosi o la morte cellulare di tipo III è stata utilizzata per descrivere la morte cellulare senza apparente coinvolgimento lisosomiale, le cui caratteristiche principali erano la disintegrazione delle strutture cellulari, la frammentazione della membrana plasmatica e il gonfiore mitocondriale. 68

INTRODUZIONE Il concetto di morte delle cellule lisosomiali (LCD) è stato presentato per la prima volta da Christian de Duve, che è stato insignito del Premio Nobel nel 1974 per la sua scoperta e caratterizzazione di lisosomi come “cestini per il riciclaggio” cellulari.

I lisosomi sono organelli cellulari a membrana singola, la cui principale funzione cellulare è quella di degradare il materiale extracellulare internalizzato dall'endocitosi/fagocitosi. Inoltre, i lisosomi degradano e riciclano i componenti intracellulari forniti tramite l'autofagia. I lisosomi contengono oltre 50 diverse idrolasi acide che mostrano attività ottimali a pH relativamente basso (4–5). Il pH lisosomiale è mantenuto dalla v-ATPasi che pompa protoni, dai canali del cloro e dai trasportatori di ioni nella membrana lisosomiale. 7 Nella membrana lisosomiale di ~8 nm, le proteine più abbondanti sono le proteine transmembrana altamente glicosilate, come le proteine di membrana 1 e 2 associate ai lisosomi (LAMP-1 e LAMP-2), che si ritiene proteggano la membrana dalla degradazione enzimi lisosomiali. Grazie alla potente capacità idrolitica degli enzimi lisosomiali, ha anche definito lisosomi come "sacche di suicidio" che possono causare autolisi cellulare e tissutale in caso di rottura.

Subito dopo la scoperta dei lisosomi, Christian de Duve formulò l'"ipotesi del sacchetto suicida", che proponeva che la distruzione e la morte cellulare fossero causate dal rilascio di idrolasi lisosomiali nel citoplasma dopo la destabilizzazione della membrana lisosomiale. 1 Mentre questa

idea è stata messa in discussione anche dallo stesso de Duve, 2 , 3è ormai chiaro che i lisosomi giocano un ruolo chiave nella morte cellulare in contesti sia fisiologici che patologici. INDUZIONE DI LMP

La via di morte cellulare più comune in cui sono implicati i lisosomi è nota come morte cellulare dipendente dal lisosoma (LDCD). La caratteristica principale di questa forma di morte cellulare regolata è la permeabilizzazione della membrana lisosomiale (LMP). Questa destabilizzazione selettiva della membrana lisosomiale consente la traslocazione nel citoplasma del contenuto lisosomiale, comprese le catepsine, che agiscono come principali esecutori di questa modalità di morte cellulare. LMP è caratterizzato come qualsiasi danno alla membrana lisosomiale che provoca il rilascio del contenuto lisosomiale nel citosol. La massiccia fuoriuscita lisosomiale provoca un aumento dell'acidità citosolica, una degradazione incontrollata dei componenti cellulari e la morte cellulare per necrosi. Tuttavia, il rilascio parziale e selettivo di catepsine, come le catepsine B e D, avvia una cascata di eventi di segnalazione cellulare che portano alla morte cellulare (Figura 2). In molti casi, la morte cellulare indotta da LMP può essere inibita, almeno parzialmente, dagli inibitori della catepsina. Numerosi stimoli esterni e interni possono avviare LMP. Questi stimoli includono agenti lisosomotropici che hanno effetti simili a detergenti o causano lisi osmotica, specie reattive dell'ossigeno (ROS) e membri della famiglia Bcl-2 proapoptotici (come Bax), che esercitano un effetto di formazione di pori sulla membrana lisosomiale. ROS E FERRO CHELANTE Il meccanismo più studiato mediante il quale viene indotto LDCD è la destabilizzazione lisosomiale mediata da ROS. A differenza di altri organelli come i mitocondri, i lisosomi mancano degli enzimi antiossidanti più comuni (come la superossido dismutasi, la catalasi o la glutatione perossidasi). Pertanto, quando i livelli di ROS sono elevati, possono facilmente attraversare e danneggiare la membrana lisosomiale. Inoltre, poiché i lisosomi sono altamente sensibili ai ROS, quelli situati nelle regioni subcellulari più vicine ai mitocondri produttori di ROS potrebbero essere più inclini a subire un danno ossidativo della membrana. I lisosomi sono organelli ricchi di ferro che derivano dalla degradazione delle proteine contenenti ferro e il ferro libero catalizza la conversione del perossido di idrogeno in radicali idrossilici altamente reattivi che possono danneggiare e destabilizzare le membrane lisosomiali. La chelazione del ferro (p. es., utilizzando la desferrioxamina mesilato) può quindi proteggere contro la LDCD indotta dal challenge ossidativo. La chelazione di altri metalli intralisosomiali come Zn 2+ e Cu 2+ protegge anche contro LDCD in diversi scenari. 73 I chelanti metallici sono stati quindi proposti per proteggere tessuti specifici dagli effetti della radioterapia durante il trattamento del cancro. Nei modelli cellulari e animali della malattia di Parkinson (MdP), le alterazioni lisosomiali mediate da ROS portano a livelli ridotti di proteine lisosomiali, rilascio di LMP e catepsina nel citoplasma. In queste condizioni, la morte cellulare possono essere attenuati mediante la somministrazione di antiossidanti e inibitori della proteasi.

Agenti lisosomotropici Gli agenti lisosomotropici, che per definizione si accumulano all'interno dei compartimenti acidi, provocano l'ingrossamento del lisosoma. Molti di loro hanno un effetto "spugna protonica", per cui le ammine non protonate sull'agente lisosomotropico assorbono i protoni mentre si accumulano nel lisosoma, con conseguente pompaggio di più protoni nel lisosoma e aumento dell'afflusso di ioni Cl - e acqua. I lisosomi ingrossati mostrano anche una ridotta motilità, che può influenzare il traffico intracellulare. 33 Uno studio recente ha scoperto che le cellule staminali neurali quiescenti hanno lisosomi sempre più grandi, che si fondono con gli autofagosomi per formare autolisosomi ma non riescono a degradare il loro contenuto. 34 Questo fenomeno è probabilmente correlato all'attivazione del TFEB; l'allargamento lisosomiale ha dimostrato di indurre l'attivazione di TFEB come meccanismo compensatorio per generare più lisosomi. La sovraespressione di TFEB nelle cellule staminali pluripotenti indotte da pazienti con malattia di Pompe induce la clearance cellulare dei lisosomi ingrossati promuovendo l'esocitosi lisosomiale/autofagosomica. Tuttavia, non è chiaro se l'allargamento lisosomiale sia necessario affinché si verifichi LMP. Repnik et al hanno suggerito che l'allargamento lisosomiale mediante intrappolamento di protoni non è sufficiente per innescare la lisi della membrana, 37 mentre altri autori hanno proposto che i lisosomi di grandi dimensioni siano più inclini alla rottura. Inoltre, è stato dimostrato che gli stessi agenti lisosomotropi inducono sia l'allargamento lisosomiale che l'LMP.

Stress lisosomiale: effetti sui lisosomi e relative risposte cellulari. In situazioni di omeostasi cellulare, il TFEB lisosomiale viene fosforilato e rimane nel citosol. In seguito a stress lisosomiale, i lisosomi si gonfiano e possono subire LMP. Se l'LMP è parziale o se è interessato solo un piccolo sottoinsieme di lisosomi, vengono avviati meccanismi di rilevamento dello stress e di risposta, tra cui la lisofagia e la regolazione del TFEB, per garantire la sopravvivenza cellulare. L'espressione della maggior parte delle proteine lisosomiali è regolata dalla rete genica di espressione e regolazione lisosomiale coordinata (CLEAR). Questa rete è a sua volta regolata dalla famiglia del fattore di trascrizione associato alla microftalmia (MiTF)/fattore di trascrizione (TFE),

che include il fattore di trascrizione EB (TFEB). La rete di geni CLEAR include geni implicati nella struttura e nella funzione dei lisosomi. L'attività del TFEB è regolata dalla fosforilazione da parte del bersaglio dei mammiferi del complesso rapamicina 1 (mTORC1). In condizioni normali, il TFEB è fosforilato e rimane nel citosol. Dopo la fame e in risposta allo stress lisosomiale, il TFEB viene defosforilato e trasloca dal citosol al nucleo, dove sovraregola la trascrizione dei geni CLEAR, come le idrolasi, le proteine della membrana lisosomiale, il complesso della pompa protonica v-ATPasi e partecipa alla regolazione di processi legati al lisosoma come endocitosi, esocitosi, fagocitosi e risposta immunitaria. È interessante notare che il TFEB controlla anche simultaneamente l'espressione di molti geni dell'autofagia e quindi regola sia l'inizio che le fasi terminali di questa via cellulare omeostatica essenziale. Il secondo meccanismo è una forma di autofagia selettiva nota come lisofagia, che assicura la rimozione dei lisosomi danneggiati e dei detriti rimasti dopo la rottura del lisosoma. 42 - 44Un gruppo di galectine citosoliche agiscono come sensori di danno endolisosomiale e LMP legando i -galattosidi lisosomiali che sono esposti sul lato citosolico della membrana lisosomiale come conseguenza dell'LMP. Alcune galectine possono reclutare direttamente componenti del macchinario dell'autofagia per avviare l'autofagia. 45 , 46 Inoltre, i lisosomi danneggiati subiscono un'ampia ubiquitinazione, con conseguente ulteriore reclutamento di componenti del macchinario di inizio dell'autofagia e la clearance a valle dei lisosomi danneggiati. 42È stato suggerito che la lisofagia rilevi grandi fori sulla membrana lisosomiale (permeabile alle galectine) e il complesso di smistamento endosomiale richiesto per il macchinario di trasporto (ESCRT), il terzo meccanismo di risposta al danno, rileva e ripara piccole rotture permeabili al protone nel lisosomiale membrana. 47 Le proteine ESCRT sono meglio conosciute per il loro ruolo nel traffico endosomiale e nella riparazione della membrana plasmatica. 48 In un recente rapporto, Skowyra et al hanno mostrato che le proteine ESCRT sono prontamente reclutate negli endosomi/lisosomi con piccole perforazioni, dove facilitano la riparazione della membrana indipendentemente dal macchinario della lisofagia. 47Tuttavia, non è ancora chiaro come questo macchinario richiuda la membrana e sono necessari ulteriori studi per chiarire il meccanismo sottostante. L'ultimo e poco compreso meccanismo di risposta al danno comporta la rimozione dei lisosomi danneggiati e disfunzionali mediante esocitosi. Nei casi di LMP più grave, i meccanismi di risposta allo stress non sono in grado di riparare i lisosomi danneggiati. Specifiche catepsine vengono rilasciate dai lisosomi permeabilizzati, con conseguente danno mitocondriale e apoptosi. Nelle situazioni più gravi, il lisosoma si rompe con conseguente rilascio massiccio di enzimi lisosomiali e morte cellulare incontrollata.. Il quarto metodo altamente sensibile per rilevare LMP è il saggio lisosomiale di galectina puncta, Come descritto sopra, le galectine citosoliche possono traslocare sulla membrana dei lisosomi che perdono. Le galectine 1 e 3 sono le più appropriate per questo dosaggio: sono ampiamente espresse e rapidamente traslocate; sono inoltre disponibili i corrispondenti anticorpi ad alta affinità. Il dosaggio della galectin puncta è in grado di rilevare l'LMP molto prima dei metodi che monitorano il rilascio di catepsina. Ad oggi, questo metodo è l'unico in grado di distinguere il sottoinsieme di lisosomi danneggiati da altri lisosomi intatti all'interno della stessa cellula e ha dimostrato che le cellule possono sopravvivere a LMP interessando un sottoinsieme di lisosomi, che vengono successivamente eliminati dall'autofagia. Il dosaggio galectin puncta può essere adattato

per l'uso con piattaforme di imaging ad alta produttività in coniugazione con altri marcatori di vitalità cellulare....