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Lisosomi come centro di controllo del metabolismo cellulare...

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Ottobre-Dicembre 2013 • Vol. 43 • N. 172 • Pp. 246-257

FRONTI

Il lisosoma: centro di controllo del metabolismo cellulare Carmine Settembre1-4, Alessandro Fraldi1, Diego L. Medina1 e Andrea Ballabio1-4 Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), Napoli Dipartimento di Genetica Molecolare e Umana, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, USA 3 Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children’s Hospital, Houston, Texas, USA 4 Genetica Medica, Dipartimento di Scienze Mediche Traslazionali, Università “Federico II”, Napoli 1

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Riassunto

Per lungo tempo, i lisosomi sono stati considerati come una sorte di “inceneritori” coinvolti nella degradazione e nel riciclo dei rifiuti cellulari. Tuttavia, sono prove convincenti che dimostrano che i lisosomi hanno una funzione molto più ampia essendo coinvolti in processi fondamentali, come la secre la riparazione della membrana plasmatica, la regolazione del metabolismo energetico e l’autofagia. Queste osservazioni pongono i lisosomi al croce diversi processi cellulari, con implicazioni significative per la salute dell’uomo. L’individuazione di un master gene, il fattore di trascrizione EB (TFE regola la biogenesi lisosomiale e l’autofagia, offre la possibilità di modulare la funzione lisosomiale aprendo nuove strategie terapeutiche per patologi le malattie da accumulo lisosomiale e altre patologie neurodegenerative.

Summary

For a long time, lysosomes were considered merely to be cellular “garbage bin” deputed to degradation of exhausted cellular material. Emerging rese is showing that lysosomes are implicated in several cellular processes such as secretion, plasma membrane repair, signaling and energy metabo Furthermore, the pivotal role of the lysosomes in autophagic pathways collocates these organelles at the crossroads of many cellular processes, which important for health and disease. The discovery of the transcription factor EB (TFEB) as master regulator of lysosomal biogenesis and autophagy unv how lysosome adapts to environmental cues, such as energy deprivation, and targeting TFEB may provide a novel therapeutic approach to modulate somal function in human disease.

Introduzione I lisosomi, descritti per la prima volta nel 1955 da Christian de Duve (de Duve, 2005), sono costituiti da un compartimento interno acido (lume), delimitato da una membrana a doppio strato lipidico, e contengono diversi tipi di idrolasi, deputate alla degradazione di specifici substrati. Integrate nella membrana lisosomiale ci sono proteine coinvolte nel trasporto di sostanze da e verso il lume, nell’acidificazione lisosomiale e nella fusione del lisosoma con altre strutture cellulari (Saftig and Klumperman, 2009). Il materiale extracellulare raggiunge il lisosoma attraverso la via dell’endocitosi (Luzio et al., 2009a), mentre i componenti intracellulari vengono trasportati al lisosoma attraverso l’autofagia (Kaushik and Cuervo, 2012; Mijaljica et al., 2011; Mizushima et al., 2008). I lisosomi possono secernere il loro contenuto mediante fusione con la membrana plasmatica (Chieregatti and Meldolesi, 2005; Verhage and Toonen, 2007). Questo processo, conosciuto come “esocitosi” lisosomiale, è molto attivo in particolari tipi di cellule, come le cellule della linea ematopoietica (Blott and Griffiths, 2002), gli osteoclasti (Mostov and Werb, 1997) e i melanociti (Stinchcombe et al., 2004). Inoltre, i lisosomi intervengono in una serie di processi biologici, come la riparazione della membrana plasmatica, l’omeostasi cellulare, il metabolismo energetico e la risposta immunitaria. Poco si sa su come la funzione lisosomiale vari nei diversi tipi cellulari e nei diversi tessuti,

ambientali è diventata evidente dopo aver scoperto che la biog e la funzione lisosomiale sono soggette a un controllo trascriz le. Questo nuovo concetto di adattamento lisosomiale è impor per la comprensione di come i processi biologici di base, che v dallo smaltimento dei rifiuti cellulari al controllo del metabo energetico, rispondano a stimoli ambientali. In questo articolo, descriveremo inizialmente la struttura del li ma e il suo ruolo noto nel processo di degradazione dei substrat lulari e poi considereremo i ruoli emergenti dei lisosomi, comp la loro funzione nella riparazione della membrana plasmatica e trasmissione del segnale, prima di discutere l’identificazione de tore di trascrizione EB (TFEB) come proteina chiave che rego biogenesi lisosomiale e l’autofagia (Sardiello et al., 2009; Sette et al., 2011). Infine, ci concentreremo su come le disfunzioni lis miali siano associate all’insorgenza di numerose patologie uma

La struttura dei lisosomi

Recentemente, numerosi articoli hanno descritto la serie comp di eventi che porta alla formazione di un lisosoma maturo (Bra and Bonifacino, 2009; Henne et al., 2011; Luzio et al., 2009b; L et al., 2007; Pfeffer, 2001; Rink et al., 2005; Saftig and Klum man, 2009; Sridhar et al., 2013; Zerial and McBride, 2001).

durante le fasi della vita e in diversi individui, così come in diverse condizioni fisiologiche. Tuttavia, negli ultimi anni, la visione statica del lisosoma si è progressivamente trasformata in una più ampia e dinamica. La capacità del lisosoma di adattarsi a diversi stimoli

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sosoma maturo ha un lume acido, circondato da una memb povera di colesterolo (Schulze et al., 2009). La funzione princ della membrana lisosomiale è di isolare l’ambiente acido aggre del lume dal resto della cellula. Ciò è garantito dalla presen

Il lisosoma: centro di controllo del metabolismo cellulare

una spessa guaina (il glicocalice) che riveste il perimetro interno e che impedisce alla membrana lisosomiale di essere degradata dalle idrolasi acide intraluminali. La membrana lisosomiale media anche attivamente la fusione dei lisosomi con altre strutture cellulari, come endosomi, autofagosomi e membrana plasmatica, nonché il trasporto di metaboliti, ioni e substrati solubili dentro e fuori dai lisosomi. Il lume lisosomiale contiene circa sessanta differenti idrolasi solubili attive a pH acido. Questi enzimi sono gli attori principali nell’esecuzione delle tappe sequenziali che sottintendono i principali processi catabolici. Gli enzimi lisosomiali comprendono membri di famiglie di proteine, come solfatasi, glicosidasi, peptidasi, fosfatasi, lipasi e nucleasi, che permettono al lisosoma di idrolizzare un vasto repertorio di substrati biologici, tra cui glicosaminoglicani, sfingolipidi, glicogeno e proteine. L’indirizzamento della maggior parte degli enzimi lisosomiali ai lisosomi, così come la loro capacità di essere secreti e ricatturati dalle cellule, è mediata da una modifica del mannosio-6 fosfato che essi subiscono nei compartimenti tardivi del Golgi (Braulke and Bonifacino, 2009; Ghosh et al., 2003). La capacità delle cellule di assumere enzimi lisosomiali attraverso il recettore del

mannosio-6 fosfato (MPR) è la base per la terapia enzimatica s tutiva per molte malattie da accumulo lisosomiale (LSD) (Neu 1980). Un diverso meccanismo di targeting, che è mediato in p dal recettore lisosomiale LIMP2 (lysosome integral membrane tein 2) è stato di recente identificato per la β-glucocerebros (Reczek et al., 2007). La figura1 illustra le funzioni principali del lisosoma e mostra a processi chiave che lo vedono coinvolto. Le proteine SNARE e sono cruciali per i processi di trafficking e fusione lisosomiale le proteine del lisosoma la proteina LAMP1 (lysosome-assoc membrane protein 1) è la più abbondante, rappresentando ci 50% delle proteine totali della membrana, ed è coinvolta nel t co lisosomiale (Andrejewski et al., 1999; Saftig and Klumper 2009). Il complesso LYNUS (Lysosome Nutrient Sensing) inc diversi complessi proteici che interagiscono sulla superficie lis miale. Il suo ruolo è quello di rilevare il contenuto di nutrienti de soma e segnalare le informazioni al nucleo (vedi di seguito). In sono stati identificati sulla membrana lisosomiale anche divers nali ionici. MCOLN1 (mucolipin 1) è un canale cationico non sele

Figura 1. Principali funzioni dei lisosomi e le loro relazioni con i processi cellulari chiave. I lisosomi sono coinvolti nel processo di degradazione e riciclo di materiale intracellulare (attraverso l’autofagia) e di materiale extracellulare ( verso l’endocitosi). Durante questi processi i lisosomi si fondono rispettivamente con gli autofagosomi e con gli endosomi tardivi. I prodotti de dalla degradazione vengono utilizzati per generare nuovi componenti cellulari e per fornire l’energia necessaria ai fabbisogni nutrizionali dell lula. I lisosomi sono sottoposti anche all’esocitosi regolata dal Ca2+ per poter secernere il loro contenuto all’interno dello spazio extracellulare

riparare i danni alla membrana plasmatica. Quando sono presenti lesioni sulla membrana plasmatica, i lisosomi migrano velocemente nel p danneggiato dove si fondono con la membrana in modo da consentire una chiusura efficiente. Più recentemente, i lisosomi sono stati ident come organelli ‘segnale’, capaci di rilevare la disponibilità dei nutrienti ed attivare una comunicazione dal lisosoma al nucleo, in modo da me la risposta alla fame e regolare il metabolismo energetico.

C. Settembre, A. Fraldi, D.L. Medina, A. Ball

(Dong et al., 2008) coinvolto nel segnale del Ca2+ durante la fusione lisosomiale con altre membrane, come la membrana plasmatica (Dong et al., 2009; LaPlante et al., 2006; Medina et al., 2011) e autofagosomica (Wong et al., 2012). Una carenza di MCOLN1 provoca la mucolipidosi tipo IV, una malattia da accumulo lisosomiale (LSD) (Bargal et al., 2000; Bassi et al., 2000). CIC7, un canale del cloro, contribuisce all’acidificazione lisosomiale ed è coinvolto nella osteopetrosi ereditaria (Jentsch et al., 2005; Kasper et al., 2005; Weinert et al., 2010). I trasportatori nella membrana lisosomiale comprendono LAMP2A, che media l’autofagia chaperone-mediata (CMA) legando alla membrana lisosomiale i substrati proteici citosolici, in modo che possano essere internalizzati e degradati (Cuervo et al., 2000; Kaushik and Cuervo, 2012). Mutazioni di LAMP2A causano la malattia di Danon, che è associata con l’accumulo di vacuoli autofagici nelle cellule muscolari (Nishino et al., 2000). NPC1 (Niemann-Pick C1 protein) è una proteina della membrana lisosomiale, coinvolta nell’export di colesterolo dal lume endolisosomiale. Mutazioni di NPC1 causano la malattia di Niemann-Pick tipo C1 (Lloyd-Evans et al., 2008). HGSNAT (heparan-α glucosaminide N-acetiltrasferase) è un enzima che partecipa alla degradazione progressiva di eparan solfato (Durand et al., 2010; Fan et al., 2006; Hrebicek et al., 2006), e le cui mutazioni causano la mucopolisaccaridosi di tipo IIIC (MPSIIIC). Siamo ancora lontani dall’identificazione e caratterizzazione funzionale di tutte le proteine lisosomiali. Sulla base dei dati attuali, sono state identificate poco più di 100 proteine residenti nei lisosomi; circa 70 di queste sono proteine della matrice lisosomiale e circa 50 sono proteine della membrana lisosomiale (Schroder et al., 2010). Tuttavia, questi numeri potrebbero aumentare nel prossimo futuro.

lascio delle idrolasi acide da parte del recettore del mannosiosfato nel lume endosomale e il riciclo del recettore all’apparat Golgi (Luzio et al., 2007). I materiali intracellulari raggiungono i lisosomi attraverso il proc di autofagia, un processo catabolico di “autodigestione” che è lizzato dalle cellule per catturare i propri componenti citoplasm destinati alla degradazione e al riciclo. Sono stati identificati t di autofagia: microautofagia; autofagia mediata da chaperone ( e macroautofagia. Durante la microautofagia, le proteine citoso sono inghiottite nel lisosoma attraverso l’invaginazione diretta membrana lisosomiale o endosomiale (Ahlberg et al., 1982; Mij et al., 2011; Sahu et al., 2011). Nella CMA, le proteine citosoliche sono trasportate nel lume somiale, attraverso l’internalizzazione mediata da chaperon recettori. Ciò richiede lo srotolamento delle proteine e la loro slocazione attraverso la membrana lisosomiale, che avviene tra la proteina LAMP2A (Chiang et al., 1989; Cuervo and Dice, 1 Kaushik and Cuervo, 2012). La macroautofagia si basa sulla b nesi di autofagosomi, che sono vescicole costituite da doppia m brana che sequestrano materiale citoplasmatico e poi si fon con i lisosomi. Pertanto, il ruolo di tutti e tre i tipi di autofag processi di degradazione e di riciclo è strettamente dipendente funzione lisosomiale. Per semplicità, da qui in poi useremo il ter autofagia per riferirci alla macroautofagia, che rappresenta principale di autofagia. L’autofagia è attivata da una vasta gamma di condizioni ce stressanti e media la degradazione di aggregati di proteine, ossidati, organelli danneggiati e agenti patogeni intracellulari. dotti di degradazione risultanti sono usati per generare nuovi ponenti cellulari ed energetici, in risposta alle esigenze nutriz della cellula. I meccanismi alla base dell’autofagia e la sua rilev Le funzioni dei lisosomi in condizioni fisiologiche e patologiche, sono stati ampiamente Le funzioni lisosomiali possono essere schematicamente suddivise diati negli ultimi dieci anni e ben descritti in articoli recenti (H in tre tipi principali: la degradazione, la secrezione e la regolazione Klionsky, 2009; Ravikumar et al., 2010). del segnale cellulare (signaling) (Fig. 1). L’esocitosi lisosomiale Degradazione lisosoma-mediata I lisosomi possono secernere i loro contenuti nello spazio extrac Analogamente al trasporto dei rifiuti urbani agli inceneritori, la rac- lare attraverso un processo chiamato esocitosi lisosomiale, che colta e il trasporto dei rifiuti cellulari ai lisosomi richiede una logisti- essere rilevata dalla traslocazione di proteine di membrana li ca complessa. La cellula ha sviluppato diverse vie per il trasporto dei miali (per esempio, LAMP1) sulla membrana plasmatica (Chiere and Meldolesi, 2005; Rodriguez et al., 1997; Verhage and Too rifiuti extracellulari e intracellulari al lisosoma. Il materiale extracellulare raggiunge il lisosoma principalmente at- 2007). In questo processo, i lisosomi si fondono con la memb traverso l’endocitosi. La cattura di materiale extracellulare e di pro- plasmatica attraverso un meccanismo regolato dal Ca2+ che è a teine integrali di membrana avviene attraverso specifici meccanismi ciato ad un grosso rilascio del contenuto lisosomiale nella ma endocitici che variano a seconda della natura della sostanza. Esempi extracellulare (Andrews, 2000; Chavez et al., 1996; Coorssen e importanti di endocitosi sono la fagocitosi, la macropinocitosi, l’en- 1996; Jaiswal et al., 2002; Rodriguez et al., 1997; Stinchcombe docitosi clatrina-mediata, l’endocitosi caveolina-mediata e l’endoci- Griffiths, 1999). tosi caveolina e clatrina-indipendente (Conner and Schmid, 2003). L’esocitosi lisosomiale non è solo responsabile della secrezio I recettori presenti sulla membrana plasmatica, una volta attivati, contenuti lisosomiali, ma ha anche un ruolo fondamentale possono essere internalizzati attraverso meccanismi di endocitosi riparazione della membrana plasmatica. Lesioni della memb mediati da clatrina (Doherty and McMahon, 2009) o meccanismi plasmatica inducono la rapida migrazione dei lisosomi al sito clatrina-indipendenti di endocitosi (Hansen and Nichols, 2009). Dopo neggiato. I lisosomi poi si fondono con la membrana plasmat l’internalizzazione, i recettori sono indirizzati agli endosomi (Sorkin risigillano efficientemente il sito danneggiato (Gerasimenko e and von Zastrow, 2009), dai quali possono essere riciclati e tornare 2001; Reddy et al., 2001). Questo processo è anche important alla membrana plasmatica per consentire l’attivazione ripetuta del meccanismi di difesa contro le infezioni batteriche (Roy et al., 2 recettore o essere destinati alla degradazione lisosomiale, con con- ed è stato implicato in un tipo specifico di distrofia muscolare seguente terminazione del segnale da parte del recettore (Haglund ratterizzata da un difetto nella riparazione della fibra muscolare et al., 2007).

and Dikic, 2012; Katzmann et al., 2001; Raiborg and Stenmark, 2009). Un caratteristico segno di maturazione endosoma-lisosoma L’esocitosi lisosomiale è regolata da TFEB, il principale regol è la progressiva diminuzione del pH interno a ~pH 5 (Ohkuma and della biogenesi lisosomiale (vedi di seguito). TFEB induce sia Poole, 1978). Il processo di acidificazione è fondamentale per il ri- gancio che la fusione dei lisosomi alla membrana plasmatica, r

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Il lisosoma: centro di controllo del metabolismo cellulare

lando l’espressione di alcuni geni, i cui prodotti proteici aumentano la dinamica lisosomiale e provocano un aumento intracellulare del Ca2+, mediato da MCOLN1 (Medina et al., 2011). È interessante notare che la regolazione dell’esocitosi lisosomiale mediata da TFEB ha un ruolo importante nel differenziamento degli osteoclasti e nel riassorbimento osseo (Ferron et al., 2013). “Signaling” lisosomiali È ormai evidente che il lisosoma svolge un ruolo importante come “sensore” dei nutrienti cellulari e nelle vie di segnalazione che sono coinvolte nel metabolismo e nella crescita cellulare. Il complesso chinasico mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1), controllore principale della crescita delle cellule e dell’organismo (Laplante and Sabatini, 2012), è localizzato sulla superficie lisosomiale (Sancak et al., 2010). La localizzazione lisosomiale di mTORC1 suggerisce una co-regolazione tra la crescita e il catabolismo cellulare. Fattori di crescita, ormoni, amminoacidi, glucosio, ossigeno e stress sono i principali attivatori di mTORC1, che a sua volta regola positivamente la biosintesi di proteine, mRNA, lipidi e la produzione di ATP (Efeyan et al., 2012; Laplante and Sabatini, 2012). In questo modo, mTORC1 regola l’equilibrio tra stati biosintetici e catabolici. Quando i nutrienti sono presenti, mTORC1 fosforila direttamente e sopprime l’attività del complesso chinasi ULK1-ATG13-FIP200 (unc-51-like kinase 1-autophagy-related 13-focal adhesion kinase family-interacting protein of 200 kDa) (Ganley et al., 2009; Hosokawa et al., 2009; Jung et al., 2009), che è necessario per indurre la biogenesi degli autofagosomi (Chan et al., 2012; Hara et al., 2008). L’inibizione di mTORC1, tramite digiuno o indotta da farmaci, porta all’attivazione di ULK1-ATG13FIP200 e all’autofagia. Pertanto, il livello di autofagia cellulare è inversamente correlata con l’attività di mTORC1e l’inibizione farmacologica di mTORC1 stimola potentemente l’autofagia. Il complesso macchinario di “signaling”, composto da mTORC1 e da ulteriori complessi proteici, è localizzato sulla superficie lisosomiale. Questo complesso, indicato come LYNUS (Lysosome Nutrient Sensing), risponde al contenuto degli amminoacidi nei lisosomi e segnala le informazioni sia al citoplasma che al nucleo. I principali componenti del complesso LYNUS sono illustrati nella figura 2. Il ruolo dei lisosomi come sensori dei nutrienti è un nuovo concetto che amplia la nostra visione di questi organelli, da semplici esecutori dello smaltimento dei rifiuti cellulari a sensori e regolatori di diverse funzioni cellulari, tra cui la progressione del ciclo cellulare, la crescita, la biosintesi di macromolecole e l’autofagia (Zoncu et al., 2011). La recente scoperta di un meccanismo di segnale lisosomanucleo indotto dal digiuno, (vedi di seguito) rinforza ulteriormente questo concetto (Settembre et al., 2012). È interessante notare che la ri-formazione lisosomiale autofagica (ALR), un processo evolutivamente conservato secondo il quale i lisosomi nascenti sono formati da membrane autolisosomiali, richiede anche la riattivazione di mTORC1 durante il digiuno prolungato (Rong et al., 2012; Rong et al., 2011; Yu et al., 2010). Inoltre, il digiuno prolungato controlla anche la ri-formazione lisosomiale attraverso l’attività di PI4KIIIβ (phosphatidylinositol 4-kinase IIIβ) (Sridhar et al., 2013).

TFEB regola la biogenesi lisosomiale e la clearance cellula

I processi di clearance cellulari mediati dai lisosomi richiedon zione coordinata d’idrolasi, processi di acidificazion...