Metabolizm wtórny roślin. PDF

Preview

Summary

Metody kultur in vitro 9. i 10. Metabolizm 1. Biosynteza w kulturach in vitro. Powstanie i najintensywniejszy jako metod hodowli miejsce lat temu. Od tamtego czasu ich znacznie szybsze i bardziej wydajne hodowle GMO, do skutecznie szlaki syntezy danych i z powodzeniem je Mimo, obecnie fitobioreaktor...

Description

Metody kultur in vitro Wykład 9. i 10. Metabolizm wtórny roślin. 1. Biosynteza metabolitów wtórnych w kulturach in vitro. Przykłady. Powstanie i najintensywniejszy rozwój bioreaktorów jako metod hodowli komórek miało miejsce 15-20 lat temu. Od tamtego czasu ich rolę znacznie ograniczyły szybsze i bardziej wydajne hodowle organizmów GMO, do których można skutecznie wklonować szlaki syntezy danych związków i z powodzeniem je otrzymywać. Mimo, że obecnie istniejące fitobioreaktory są pozostałością poprzedniego boomu to ciągle ma miejsce usprawnianie technik związanych z reaktorową hodowlą glonów oraz roślin, co spowodowane jest dużym zapotrzebowaniem rynku m.in. na roślinne metabolity wtórne szczególnie te, które trudno pozyskiwać ze środowiska naturalnego. Zaletami produkcji metabolitów w kulturach tkankowych i komórkowych są: • ścisła kontrola i optymalizacja procesów biosyntezy; • niezależność od warunków klimatycznych; • możliwość hodowli tkanek bezpośrednio związanych z syntezą metabolitu (bardzo często są to owoce czy nasiona, ale także łyko); • brak ograniczeń związanych z ochroną roślin; • niebezpieczne metabolity (np. narkotyki) można produkować pod ścisłą kontrolą; • poprzez zastosowanie odpowiednich zabiegów technologicznych można przyspieszyć i zintensyfikować produkcję metabolitów oraz ułatwić ich oczyszczanie: o związki biologicznie czynne wytwarzane przez rośliny w warunkach naturalnych są wytwarzane z bardzo różną intensywnością w zależności od temperatur, pór roku, wilgotności itp. Wadami takich bioreaktorów są: • powolny wzrost; • podział raz na dwa/trzy dni czy nawet tydzień w tkankach roślin wyższych; • wysoki koszt inwestycji (zaprojektowanie systemu hodowli jałowej): o zintensyfikowane przez powolny wzrost (rozwój infekcji przewyższa rozwój hodowli); • niska wydajność produkcji metabolitów: o rośliny produkują większą ilość związków bioaktywnych w niesprzyjających warunkach, ale to przekłada się na zmniejszoną biomasę 1; • duża zmienność genetyczna i trudność w prawidłowej ekspresji genów kodujących metabolity wtórne w warunkach in vitro: o po kilku latach utrzymywania komórek mogą zachodzić zmiany zarówno nowotworowe jak i zmieniające ekspresję wielu genów. Mimo tych wad, hodowle in vitro nadal znajdują zastosowanie w produkcji metabolitów wtórnych ze względu na fakt, że chemiczna ich synteza nie jest opłacalna, umożliwia pozyskiwanie związków bioaktywnych z gatunków zagrożonych, a także umożliwia dodanie prekursorów lub elicytorów (głównie biotycznych) do hodowli zwiększających produkcję metabolitów wtórnych. Czynnikami wpływającymi na wydajność produkcji metabolitów wtórnych są: • genotyp linii komórkowej (np. czy w genie produkującym dany metabolit dołączona jest sekwencja sekrecyjna kierująca powstały związek do pożywki, co powoduje brak utraty materiału biologicznego); 1

przykładem na to jest porównanie biomasy oraz zawartości olejków eterycznych mięty pieprzowej rosnącej w niesprzyjających warunkach na podłożu piaskowym a miętą pieprzową uprawianą w optymalnych, szklarniowych warunkach do sprzedaży w hipermarkecie: mięta pochodzenia naturalnego będzie mniejsza, ale będzie zawierać więcej metabolitów wtórnych.

• • • • • •

warunki prowadzenia kultury zapewniające optymalne parametry wzrostu oraz sprzyjające procesom syntezy metabolitów (Japonia jest pionierem w produkcji metabolitów wtórnych ze względu na małą ilość naturalnych siedlisk); dodatek elicytorów i prekursorów; usuwanie metabolitów z wnętrza komórki i pożywki; zwiększenie szybkości biosyntezy metabolitów przez zastosowanie immobilizacji komórek oraz kultury o dużej gęstości; ukierunkowanie akumulacji metabolitu do określonych przedziałów komórkowych; ograniczenie przemian metabolitów przez system enzymatyczny rośliny oraz na drodze autooksydacji. ELICYTOR

METABOLIT WTÓRNY

KULTURA ROŚLINNA

wodny ekstrakt grzybni Aspergillus flavus

barwniki antocyjanowe

marchew zwyczajna (Daucus carota)

oligogalakturonidy

szikonina

nawrot (Lithospermum erythorhizon)

chitazon

wanilina

wanilia płaskolistna (Vanilla planifolia)

ściana komórkowa Phytophthora megasperma

ajmalicyna

katarantus różowy (Catharanthus roseus)

Tabela 1. Przykłady elicytorów stosowanych w celu zwiększenia biosyntezy niektórych metabolitów wtórnych. METABOLIT WTÓRNY

ROŚLINA

KRAJ POCHODZENIA

szikonina

Lithospermum erythorhizon

Japonia

berberyna

cynowód (Coptis japonica)

Japonia

winkamina

barwinek pospolity (Vinca minor)

Włochy

saponiny

żeń-szeń właściwy (Panax ginseng)

Japonia

kwas rozmarynowy

porzkywa brazylijaska (Coleus blumei)

Niemcy

geraniol

bodziszek (Geranium sp.)

Japonia

purpuryna

marzana (Rubia okane)

Japonia

Tabela 2. Przykłady metabolitów wtórnych produkowanych w systemach in vitro.

Szkionina – pierwszy metabolit wtórny produkowany w kulturach in vitro wykorzystywany w przemyśle kosmetycznym do produkcji szminek. Szikonina i jej pochodne wykazują działanie przeciwzapalne, antyseptyczne, przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze, przeciwwirusowe (stosowana w leczeniu opryszczki), przeciwzakrzepowe oraz przeciwnowotworowe. Metabolit ten na początku produkowany był w dwuetapowych kulturach okresowych zastąpionych przez kultury korzeni transformowanych.

Rysunek od 1. do 3. Lithospermum erythorhizon, wyizolowana z niego szikonina oraz jej wzór strukturalny.

Antocyjany – grupa organicznych związków chemicznych z klasy flawonoidów, do syntezy których w większości przypadków niezbędne jest światło. Najbardziej zaawansowane prace nad ich produkcją prowadzone są w Japonii: w czasie 16-dniowej kultury aralii prowadzonej w ciemności uzyskano około 1 grama czystego barwnika z 1 litra pożywki (wykazanie 55krtonego wzrostu ilości barwnika w stosunku do warunków polowych).

Rysunek od 4. do 6. Marchew zwyczajna, aralia sercowata oraz wzór strukturalny izolowanego z tych roślin związku antocyjanowego.

Betalainy – grupa barwników zawierających azot występująca wyłącznie w podklasie goździkowych. Do produkcji czerwonych betacyjanin wykorzystywana jest komosa czerwona (zawartość barwnika na poziomie 1% suchej masy wynikająca z dużej akumulacji w wakuolach), natomiast czerwona betanina i żółta wulgaksantyna-1 produkowane są także z wykorzystaniem korzeni transformowanych buraka czerwonego (barwniki wydzielane do pożywki w momencie zaprzestania mieszania).

Rysunek od 7. do 10. Komosa czerwona, szarłat (Caryophyllidae) oraz wzór strukturalny izolowanej z tych roślin betalainy.

! 2. Metabolizm wtórny roślin. Metabolity wtórne (produkty wtórne) – specyficzne substancje syntetyzowane przez rośliny, które nie są niezbędne do przeprowadzania podstawowych procesów życiowych i nie są

produkowane w szlakach metabolizmu pierwotnego. Funkcjami metabolitów wtórnych w roślinach są: • ochrona przed roślinożercami i patogenami; • absorpcja szkodliwego promieniowania ultrafioletowego (UV); • stanowią czynniki wabiące (atraktanty) zwierzęta zapylające kwiaty i rozsiewające nasiona (kolor, zapach, smak); • są czynnikami pośredniczącymi w oddziaływaniach między roślinami oraz między roślinami a mikroorganizmami: o allelopatia – termin wprowadzony w 1937 roku przez Molischa, wywodzący się z języka greckiego (gr. allon – wzajemny; patheia – oddziaływanie, cierpienie, choroba) oznaczający oddziaływanie między roślinami zarówno dodatnie jak i ujemne; o substancjami allelopatycznymi mogą być gazy, terpeny, kwasy organiczne lub związki fenolowe. Najważniejszymi grupami metabolitów wtórnych są: terpenoidy, związki fenolowe oraz niebiałkowe związki azotowe. W szlak metabolizmu wtórnego wchodzi około 4/5 związków wyprodukowanych na drodze metabolizmu pierwotnego, a rośliny są w stanie wytwarzać jeden produkt na wielu szlakach metabolicznych w zależności od dostępności substratowej. Podobnie jak w innych reakcjach (oddychania tlenowego, fotosyntezy) acetylokoenzym A sprzęga wiele z tych szlaków.

Rysunek 11. Podstawowe szlaki metaboliczne wytwarzania metabolitów wtórnych organizmów roślinnych.

Rysunek 12. i 13. Mechanizmy allelopatii oraz przedostawanie się związków allelopatycznych do środowiska: a – przechodzenie do atmosfery substancji lotnych; b – absorbowanie przez inne rośliny lub wiązane na powierzchni gleby; c – ługowanie z nadziemnych części roślin pod wpływem deszczu lub rosy; d – wnikanie do gleby pod wpływem rozkładu resztek roślinnych; e – wnikanie do gleby w formie eksudatów korzeniowych.

3. Przegląd terpenoidów. Terpenoidy (terpeny, izoprenoidy) – bardzo liczna i zróżnicowana grupa związków, w większości nierozpuszczalnych w wodzie. Mogą mieć strukturę łańcuchową lub cykliczną. Powstają z acetylo-CoA lub ze związków syntetyzowanych podczas glikolizy. Podstawowym elementem budowy wszystkich terpenów jest 5-węglowa jednostka izoprenowa z wiązaniami wielokrotnymi (izopren), a szlaki ich syntezy są proste: kwasu mewalonowego i fosforanu metyloerytrolu. Dystrybucją terpenów zajmują się włoski wydzielnicze. Terpenoidy mają funkcje zarówno w: • metabolizmie pierwotnym: o przenoszenie elektronów i protonów (plastochinony i ubichinony); o fotosynteza (karotenoidy, fitol chlorofilu); o przenoszenie grup polisacharydowych (fosforany poliprenoli); o składniki błon; o hormony roślinne (GA, ABA, BA); • jak i metabolizmie wtórnym: o nadają barwę kwiatom i owocom; o pełnią funkcję ochronną przed infekcją czynników patogennych; o ze względu na nieprzyjemny smak lub właściwości trujące stanowią czynniki odstraszające roślinożerców; o są związkami allelopatycznymi. Podział terpenów opiera się na liczbie atomów węgla w cząsteczce. Wśród nich można wyróżnić: • monoterpeny (10C, 2 jednostki izoprenowe): składniki olejków eterycznych (np. pinen, rzadko produkowany w kulturach in vitro), insektycydy; • seskwiterpeny (półtoraterpeny, 15C, 3 jednostki izoprenowe): składniki olejków eterycznych, związki wyjściowe do produkcji fitoaleksyn i ABA; • diterpeny (20C, 4 jednostki izoprenowe): składniki żywic, fitolu, związki wyjściowe do produkcji fitoaleksyn i GA: o forbol produkowany przez wilczomleczowate; o taksol produkowany przez cis (pochodna toksycznego detaksolu, izomer L produkowany w bioreaktorach ze względu na właściwości antynowotworowe); • triterpeny (30C, 6 jednostek izoprenowych): składniki błon komórkowych, związki wyjściowe do produkcji fitoaleksyn i BA; • tetraterpeny (40C, 8 jednostek izoprenowych): karotenoidy (np. likopen);

politerpeny (>20 jednostek izoprenowych): kauczuk (nie da się go otrzymać syntetycznie). Terpeny produkowane są przez komórki włoska wydzielniczego i przechowywane w zaokrąglonej „czapeczce” znajdującej się na szczycie włoska. Powstaje ona w wyniku uwypuklenia fragmentu kutykuli i ściany komórkowej komórki wydzielniczej. Składnikami olejków eterycznych są głównie monoterpeny i seskwiterpeny. •

Rysunek od 14. do 16. Wzór strukturalny podstawowej jednostki budulcowej terpenów – izoprenu, Balsamorhiza sagittata oraz obraz spod mikroskopu elektronowego włoska wydzielniczego tego gatunku.

Monoterpeny – ich główną funkcją jest odstraszanie owadów i innych organizmów roślinożernych ze względu na fakt, że dla niektórych gatunków chrząszczy i szkodników drzew są związkami toksycznymi. Ich synteza ulega wzmożeniu na skutek inwazji owadów (np. limonen lub mentol). Pinen występuje w żywicy niektórych gatunków drzew iglastych (sosna, jodła) i występuje w postaci dwóch izomerów: α oraz β. Jest głównym składnikiem terpentyny otrzymywanej z żywicy sosnowej i stosowany jest w kosmetyce jako składnik perfum oraz jako surowiec do otrzymywania innych środków zapachowych.

Rysunek 17. i 18. Wzór strukturalny limonenu i mentolu oraz rośliny wytwarzające te związki: cytryna zwyczajna i mięta pieprzowa.

Seskwiterpeny – są oleistymi cieczami lub substancjami stałymi, które mogą tworzyć estry wewnątrzcząsteczkowe, czyli laktony. Pochodne seskwiterpenów (kostunolid) występują u niektórych gatunków z rodziny astrowatych (Asteraceae) i nadają roślinom gorzki smak, co powoduje, że są one omijane przez roślinożerne owady oraz ssaki. Występujący w niektórych odmianach bawełny gossypol jest nie tylko związkiem odstraszającym, ale także ważnym czynnikiem zapobiegającym zakażeniom bakteryjnym i grzybowym.

Rysunek 19. i 20. Bawełna kosmata oraz wzór strukturalny gossypolu.

Diterpeny – przykładem związku z tej grupy jest kwas abietynowy, który jest jednym z najważniejszych kwasów żywicznych, występujący w żywicy drzew iglastych (głównie jodeł). Jest żółtawym, nierozpuszczalnym w wodzie, ale rozpuszczalnym w C2H5OH i tłuszczach proszkiem wykazującym działanie przeciwbakteryjne. Stosowany do wyrobu pokostu, lakieru oraz mydeł. Forbol, również należący do diterpenów występuje u niektórych gatunków roślin z rodziny wilczomleczowatych (Euphorbiaceae). Posiada właściwości karcinogenne, a jego estry wykazują szerokie spektrum aktywności biologicznej, m.in. hamują cytopatyczny efekt wirusa HIV-1, a także odznaczają się aktywnością antyleukemiczną. Kolejnym ważnym związkiem z tej grupy jest: • taksol – związek o właściwościach cytostatycznych i przeciwnowotworowych występujący w korze, igłach i korzeniach różnych gatunków cisa (Taxus). Taksol i jego zmodyfikowane pochodne, czyli taksoidy stanowią skuteczne leki w terapii różnych nowotworów (m.in. jajnika, sutka i płuc). Zaburzają one proces podziału komórki i w rezultacie namnażanie komórek nowotworowych oraz indukują apoptozę.

Rysunek od 21. do 24. Korton przeczyszczający i wzór strukturalny wytwarzanego przez tę roślinę forbolu oraz cis pospolity i wzór strukturalny taksolu.

Triterpeny – najważniejszymi związkami tej grupy są glikozydy nasercowe, czyli sterole roślinne połączone z cukrami (najczęściej glukozą lub mannozą). Są to związki o gorzkim smaku i dużym stopniu toksyczności dla człowieka oraz innych kręgowców. Hamują one

działanie ATP-az sodowo-potasowych w mięśniu sercowym, a stosowane w małych dawkach spowalniają i wzmacniają pracę serca, dlatego też są powszechnie używane jak lekarstwa, głównie w leczeniu niewydolności mięśnia sercowego. Stosowane w nadmiarze powodują zawał serca.

Rysunek 25. i 26. Naparstnica purpurowa oraz wzór surowca z niej pozyskiwanego: digitoksyny.

Tetraterpeny – należą do nich m.in. karotenoidy, wśród których wyróżnia się czerwonopomarańczowe karoteny zbudowane wyłącznie z węgla i wodoru oraz pomarańczowo-żółte ksantofile, mające w cząsteczce dodatkowo tlen. Karotenoidy pełnią bardzo zróżnicowane funkcje: • uczestniczą w procesie fotosyntezy (tworzą anteny energetyczne); • chronią aparat fotosyntetyczny przed nadmiarem wzbudzeń oraz procesami fotooksydacji; • nadają przywabiające zwierzęta barwy kwiatom oraz nasionom: o likopen – czerwony barwnik z grupy karotenów, w który obfitują owoce pomidora, arbuza i dzikiej róży. Likopen zmniejsza ryzyko powstawania chorób przewlekłych, ale przede wszystkim chroni przed nowotworami oraz chorobami układu krążenia. Związane jest to z właściwościami antyoksydacyjnymi likopenu, które są trzykrotnie większe niż β-karotenu.

Rysunek od 27. do 30. Pomidor zwyczajny, wyizolowany z owoców likopen oraz jego wzór strukturalny.

Politerpeny – których reprezentantem jest m.in. kauczuk, będący składnikiem soku mlecznego (lateksu) roślin kauczukodajnych. Obecnie najbardziej ceniony jest jako źródło lateksu kauczukowiec brazylijski (Hevea brasiliensis). Cząsteczki kauczuku są liniowymi polimerami izoprenu o konfiguracji podstawników wokół podwójnego wiązania typu cis. Kauczuk jest

półproduktem do otrzymywania gumy w wyniku wulkanizacji, czyli chemicznego sieciowania cząsteczek. 4. Przegląd związków fenolowych. Związki fenolowe (fenole) – zawierają w swoich cząsteczkach pierścień aromatyczny posiadający grupę hydroksylową i inne podstawniki takie jak grupa karboksylowa (COOH) lub metoksylowa (CH3O). Fenole występujące u roślin są bardzo zróżnicowane pod względem chemicznym. Niektóre z nich są rozpuszczalne w wodzie, a inne w rozpuszczalnikach organicznych. Pozostałe to duże, nierozpuszczalne polimery. Funkcjami związków fenolowych są m.in.: • ochrona przed patogenami i roślinożercami; • przywabianie zwierząt zapylających i rozsiewających; • absorpcja promieniowania UV; • ograniczenie wzrostu sąsiadujących roślin.

Rysunek 31. Wzór strukturalny podstawowej jednostki budujących związki fenolowe (fenol).

Wśród występujących u roślin fenoli można wyróżnić: proste związki fenolowe, taniny oraz flawonoidy. Są one produkowane na drodze szlaku kwasu szikimowego oraz kwasu malonowego. W szlaku kwasu szikimowego z metabolitów glikolizy i cyklu pentozofosforanowego powstają aminokwasy aromatyczne z których następnie powstają związki fenolowe, a szlak ten obecny jest nie tylko u roślin, ale także grzybów i bakterii. Glifosat (znany pod komercyjną nazwą Roundup) to inhibitor tej drogi metabolicznej blokujący dołączanie fosfoenolopirogronianu do kwasu szikimowego.

Rysunek 31. Szlaki biosyntezy związków fenolowych.

Proste związki fenolowe – niskocząsteczkowe fenole, do których zalicza się m.in fenylopropanoidy (kwas cynamonowy, kumarynowy czy kofeinowy) zawierające w cząsteczce pierścień benzenowy i trójwęglowy łańcuch węglowy. Kwas kawowy i felurowy występują np.

w jemiole pospolitej czy glistniku jaskółcze ziele i mają właściwości przeciwzapalne, immunostymulujące, przeciwmiażdżycowe, antyagregacyjne, fungistatyczne i bakteriostatyczne.

Rysunek 32. i 33. Ogólna struktura fenylopropanoidów, wzór strukturalny kwasu kawowego i felurowego oraz produkujący je glistnik jaskółcze ziele.

Innymi związkami tego typu są laktony fenylopropanoidowe zwane kumarynami, które również zawierają pierścień benzenowy i trójwęglowy łańcuch, ale są toksyczne dla zwierząt roślinożernych. Kumaryny to cykliczne laktony kwasu kumarynowego. Kwas ten ma samoistną tendencję do tworzenia wiązania estrowego w wyniku, którego powstaje lakton zwany kumaryną. Pod względem budowy dzieli się je na: • kumaryny – zasadniczym rdzeniem jest bezno-α-piron; • furanokumaryny – w których doszło do kondensacji cząsteczki kumaryny z furanem (2 pierścienie benzenowe i 1 pierścień pentanowy); • piranokumaryny – gdzie cząsteczka kumaryny jest połączona z heterocyklicznym piranem (3 pierścienie beznenowe).

Rysunek 34. Reakcja spontanicznego wytwarzania wiązania estrowego kwasu kumarynowego, w wyniku czego powstaje kumaryna (lakton).

Jedną z najczęściej spotykany w przyrodzie kumaryn jest umbeliferon. Występuje w roślinach z rodzin: baldaszkowatych, złożonych, psiankowatych i innych. Jest jednym ze składników olejku eterycznego rumianku pospolitego i zwykle występuje w wolnej postaci (aglikonu). Umbeliferon posiada zdolność do absorpcji ultrafioletowej części widma słonecznego, należy więc do tak zwanych substancji fotoochronnych. Z tego względu pochodne tego związku (np. octan umbeliferonu) znalazły zastosowanie przy produkcji kosmetyków. Lignina natomiast również należy do związków fenolowych i jest polimerem fenylopropanoidów.

Rysunek 35. Wzór strukturalny umbeliferonu oraz produkujący ten związek pasternak zwyczajny.

Pochodne kwasu benzoesowego powstają poprzez skrócenie łańcucha węglowego o dwa atomy węgla (zbudowane więc z jednego pierścienia benzoesowego oraz grupy metylowej). W ten sposób powstają m.in.:

• •

wanilina – stała substancja bezbarwna, jeden ze składników aromatycznych wanilii płaskolistnej występująca w jej owocach. Otrzymywana także w sposób syntetyczny, używana do aromatyzowania produktów spożywczych m.in. w cukiernictwie; kwas salicylowy – reguluje mechanizmy obronne roślin. Poziom tego związku wzrasta w wyniku...