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El estudio de métodos cromatográficos...

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Introducción a los Métodos Cromatográficos

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Tema 10

INTRODUCCION A LOS METODOS CROMATOGRAFICOS Los métodos que se utilizan en análisis químico presentan una selectividad más o menos alta, si bien, existen muy pocos que sean verdaderamente específicos. Por ello, en muchas ocasiones, la separación del analito de las posibles sustancias interferentes suele ser una etapa fundamental en los procedimientos analíticos. Sin duda, la Cromatografía es uno de los métodos de separación más poderosos que se hayan descubierto. Fue desarrollada originalmente por el botánico ruso M. S. Tswett como técnica para la separación de pigmentos vegetales coloreados, y la I.U.P.A.C.* la define como: "Un método utilizado inicialmente para la separación de los componentes de una muestra en la cual los componentes se distribuyen en dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra se mueve. La fase estac ionar ia puede ser un sólido, un líquido sobre un soporte sólido, o un gel. La fase estacionaria puede estar contenida en una columna, extendida en forma de capa o dispuesta en forma de película …. La fase móvil puede ser gaseosa o líquida".

El término "cromatografía" posiblemente derive de las palabras griegas "chroma" (color) y "graphein" (escribir), aludiendo a que los pigmentos vegetales separados se ponen claramente de manifiesto como bandas coloreadas. Sin embargo, el mismo Tswett indica que también pueden separarse sustancias incoloras por el mismo procedimiento. Cuando se utiliza una columna rellena de CaCO3 (figura 10.1.a.), en la que se introduce un extracto de hojas verdes en éter de petróleo, y seguidamente se añade disolvente puro (eluyente) es posible la separación de clorofila, carotenos y xantofilas. En estas separaciones, la fase estacionaria es el relleno (CaCO3), la fase móvil es el éter de petróleo y los componentes a separar, los distintos pigmentos vegetales, los cuales se encuentran sometidos a dos fuerzas contrarias: el disolvente tiende a arrastrarlos hacia la salida y el CaCO3 a retenerlos. Como este último efecto es

* I.U.P.A.C. "Compendium of Analytical Nomenclature". Pergamon Press. Oxford (1977).

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diferente para los distintos pigmentos, éstos se mueven a diferente velocidad y emergen de la columna a distintos tiempos (figura 10.1.b.c.d.) disolvente puro (eluyente) extracto de hojas verdes en éter de petróleo

CaCO 3

.

eluato

a

b

c

d

Figura 10.1. Separación hipotética de tres componentes de una mezcla por cromatografía en columna.

Cuando se mide la concentración de cada componente a la salida de la columna y se representa en función del volumen de fase móvil, o del tiempo transcurrido desde la introducción de la muestra, se obtiene una gráfica como la representada en la figura 10.2., denominada "cromatograma"*.

R

volumen o tiempo

Figura 10.2. Cromatograma de la mezcla de tres componentes de la figura 10.1. * Aunque es posible recoger distintas fracciones de fase móvil que sale de la columna y determinar en cada una de ellas la concentración de soluto, normalmente el efluente se monitoriza continuamente con un detector que mide alguna propiedad física o química del soluto o de la fase móvil.

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La cromatografía es una técnica cuyo campo de aplicación se extiende a todas las áreas de la Química y de la Bioquímica. Asimismo, es importante en Biología, Control de Calidad, Investigación, Análisis, separaciones a escala preparativa y medidas fisicoquímicas. Asimismo, puede aplicarse con el mismo éxito tanto a escala micro como macro, siendo posible su utilización industrial para la separación de los componentes en los más diversos materiales: azúcares, tierras raras, productos farmacéuticos, etc.

CLASIFICACION DE LOS METODOS CROMATOGRAFICOS Los métodos cromatográficos pueden clasificarse atendiendo a distintos factores: estado físico de las fases móvil y estacionaria (gas-líquido, líquido-líquido, etc), soporte utilizado (columna, papel, etc), mecanismo de la separación (adsorción, reparto), e incluso el tipo de soluto (cromatografía iónica, cromatografía de proteínas, etc). En el cuadro de la figura 10.3. se muestra una clasificación en función de algunos parámetros mencionados anteriormente.

1. 2. 3. 4.

Cuando se utiliza como fase móvil un fluido a presión y temperatura superiores a la crítica se tiene un tipo de cromatografía denominada de fluido supercrítico. Además de los mecanismos mencionados existen otros tales como: fase enlazada, interacción iónica, afinidad, quelación. El mecanismo es de adsorción cuando la fase móvil en un líquido polar. El mecanismo puede ser de reparto cuando la fase móvil es un líquido no polar

Figura 10.3. Clasificación de los métodos cromatográficos

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Según la naturaleza de la fase móvil, los métodos cromatográficos se clasifican en dos grupos: cromatografía líquida y cromatografía de gases (además de la mencionada en el pie de la figura 10.3. de fluidos supercríticos), según que la fase móvil sea un líquido o un gas respectivamente. En cromatografía líquida, cuando la fase estacionaria es polar y la fase móvil nopolar, se denominan sistemas normales, o de fase normal. En estos sistemas, la retención del soluto se incrementa generalmente con su polaridad. Por otra parte, si la fase estacionaria es menos polar que la fase móvil, el sistema se designa como de fase inversa, y en éstos, las especies polares tienen poca afinidad por la fase estacionaria, siendo eluidos más fácilmente. En cuanto al soporte, o la técnica utilizada para desarrollar el cromatograma, pueden distinguirse dos categorías: plana y en columna. En cromatografía plana, la fase estacionaria puede estar constituida por una hoja de papel (cromatografía en papel) o por una capa de un sólido distribuido uniformemente sobre una lámina de vidrio, plástico o aluminio (cromatografía de capa fina). Por otra parte, la fase estacionaria puede estar contenida en una columna, en cuyo caso la técnica se denomina cromatografía en columna. Cuando la fase estacionaria es un líquido, éste debe inmovilizarse sobre un soporte sólido inerte, o sobre la propia columna. Evidentemente, la cromatografía plana está limitada al uso de fase móvil líquida, debido a las dificultades inherentes para confinar un gas o un fluido supercrítico en una superficie plana. Sin embargo, la cromatografía en columna puede utilizarse en las modalidades de líquidos, gases y fluidos supercríticos. En el caso de la cromatografía líquida en columna existen dos modalidades, que pueden denominarse en función de su desarrollo cronológico como cromatografía clásica en columna y cromatografía de alta resolución (CLAR o HPLC)*

Columnas cromatográficas Las columnas convencionales usadas en cromatografía líquida y de gases tienen diámetros relativamente grandes: 2-4 mm en CG y 4-6 mm en HPLC. Estas columnas contienen la fase estacionaria empacada, consistente en un sólido o un líquido volátil recubriendo a un soporte sólido inerte. Desde 1957 se han venido desarrollando distintos tipos de columnas capilares (también denominadas columnas tubulares abiertas) utilizadas inicialmente en CG y * Las siglas HPLC corresponden a las iniciales de la denominación en inglés High Performance Liquid Chromatography.

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extendiéndose posteriormente a CL e incluso a cromatografía de fluidos supercríticos. Estas columnas son mucho más estrechas y mucho más largas que las columnas empacadas. En ellas, la fase estacionaria sólida está constituida por una capa porosa (figura 10.4.a) y la fase estacionaria líquida puede estar recubriendo directamente la pared interna de la columna (figura 10.4.b.), o sobre un soporte sólido (figura 10.4.c.). fase estacionaria sólida fase estacionaria líquida

soporte sólido recubierto con fase estacionaria líquida

pared de la columna

a

b

c

Figura 10.4. Columnas tubulares abiertas. a) de capa porosa. b) con pared recubierta. c) con soporte recubierto.

Las columnas tubulares abiertas proporcionan mayor resolución, requieren menor tiempo para el análisis y presentan mayor sensibilidad que las columnas empacadas, si bien, se maneja una cantidad de muestra considerablemente menor y no son útiles para separaciones preparativas en las que se trate de aislar cantidades relativamente grandes de compuesto.

Mecanismo de las separaciones cromatográficas La naturaleza de las interacciones entre los distintos componentes de la muestra y las dos fases, móvil y estacionaria, permite clasificar los sistemas cromatográficos desde este punto de vista, si bien, puede considerarse que la fase estacionaria es la que gobierna el modo de separación. Las fuerzas implicadas en estas interacciones suelen ser débiles, tales como fuerzas de Van der Waals o enlaces de hidrógeno.

La cromatografía de adsorción se tiene cuando la fase estacionaria es un sólido adsorbente de gran área superficial (gel de sílice, alúmina, etc.). Los centros activos situados sobre la superficie del sólido (por ejemplo, los grupos silanol de la gel de sílice) interaccionan con los grupos funcionales polares de los compuestos a separar (figura 10.5.a.). La separación se produce como consecuencia de la distinta intensidad de las mencionadas interacciones para unos y otros compuestos.

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Las primitivas separaciones de Tswett corresponden a un mecanismo de adsorción. Actualmente aún se utiliza la adsorción en algunas separaciones por cromatografía líquida en columna, si bien, su principal campo de aplicación corresponde a la cromatografía de capa fina. Por otra parte, las aplicaciones de la adsorción en cromatografía de gases se limitan fundamentalmente a separaciones donde los analitos son gases permanentes. Una característica importante del adsorbente es el tamaño de partícula. En principio, la retención es proporcional al área superficial, la cual, a su vez, depende del tamaño de partícula y de la estructura interna de las partículas de adsorbente. Cuanto menor sea el tamaño de partícula, mayor será el área superficial del adsorbente y, en consecuencia, mayor el número de centros activos disponibles para la adsorción.

La cromatografía de reparto tiene lugar cuando se utiliza un líquido como fase estacionaria. Para inmovilizar este líquido se utiliza un soporte sólido (gel de sílice, celulosa, tierra de diatomeas, poli-estireno, etc.) de gran área superficial. En cromatografía líquido-líquido, para evitar que se mezclen las fases se utiliza como fases móvil y estacionaria dos líquidos de polaridades muy diferentes. Si el líquido estacionario es polar (por ejemplo, etilen-glicol), la fase móvil será no polar (por ejemplo, hexano). En este caso, los solutos polares son retenidos más fuertemente que los no polares. La forma citada es la de operación normal, si bien también puede operarse con una fase estacionaria no polar (por ejemplo, decano) y con una fase móvil polar (por ejemplo, agua). Esta forma de proceder se denomina de fase inversa. En cualquier caso, la separación se produce porque las moléculas de soluto se distribuyen entre las dos fases según su solubilidad relativa en cada una de ellas* (figura 10.5.b.).

En la cromatografía de intercambio iónico, la fase estacionaria es una matriz rígida, en cuya superficie existen grupos funcionales cargados positiva o negativamente (A) y contra-iones de carga opuesta (M), susceptibles de intercambiarse con iones de la misma carga contenidos en la fase móvil (figura 10.5.c.) Intercambio catiónico: Matriz-A– M+ + X+ —> Matriz-A–X+ + M+ * Frecuentemente, en cromatografía líquido-líquido, la fase estacionaria está unida quimicamente al soporte

sólido, en lugar de estar simplemente depositado sobre el. En este caso, se tiene la denominada cromatografía de fase enlazada (bonded-phase chromatography, BPC). El mecanismo de las separaciones por esta técnica es complejo, si bien, parece que implica una combinación de adsorción y reparto, dependiendo de las condiciones experimentales. En HPLC, la utilización de la BPC está muy generalizada.

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Introducción a los Métodos Cromatográficos Intercambio aniónico: Matriz-A+M– + Y– —> Matriz-A+Y– +M–

La fase móvil suele ser una solución acuosa tamponada y la separación se produce por la competencia que se establece entre los iones de la fase móvil y los iones del analito por los centros activos de la resina. Este tipo de cromatografía se utiliza ampliamente en química inorgánica para la separación de iones metálicos, así como en sistemas biológicos para la separación de compuestos iónicos solubles en agua. interfase fase móvil

fase estacionaria sólida

fase móvil

fase estacionaria líquida

soluto

. centros activos

a) adsorción

fase móvil

.

+

grupo funcional

fase estacionaria sólida

b) reparto

fase móvil

fase estacionaria sólida

+ contraión

c) intercambio iónico

d) exclusión

Figura 10.5. Representación esquemática de algunos mecanismos de separaciones cromatográficas.

La cromatografía de exclusión también se denomina cromatografía de filtración en gel o cromatografía de permeación en gel. En ella, la fase estacionaria consiste en un sólido inerte que contiene pequeños poros en los que pueden penetrar las moléculas

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de tamaño reducido, pero no las grandes (figura 10.5.d.). El grado de retención depende del tamaño de las moléculas (solvatadas) y del tamaño de los poros. Las moléculas pequeñas pueden penetrar en los poros pequeños, mientras que las de tamaño intermedio pueden penetrar solo en algunos poros, siendo excluidas de los otros, y las moléculas grandes son excluidas completamente, Estas últimas se desplazan con la fase estacionaria y son eluidas en primer lugar. Este tipo de cromatografía resulta especialmente adecuada para la separación de especies orgánicas de peso molecular elevado de otras moléculas pequeñas*.

FUNDAMENTOS TEORICOS Se presentan seguidamente los conceptos en los que se basan las separaciones cromatográficas y aquellos parámetros que son de utilidad para comprender y mejorar la calidad de los cromatogramas.

CONSTANTE DE DISTRIBUCION Y SEPARACIONES Los componentes a separar, en su desplazamiento a lo largo del sistema cromatográfico se mueven a diferentes velocidades, dependiendo de la afinidad de cada uno por la fase estacionaria, respecto a la fase móvil. Cada uno de ellos se distribuye entre las dos fases según un equilibrio caracterizado por una constante denominada constante de distribución o coeficiente de distribución. Para el componente A, Amóvil Aestacionaria KA=

AS AM

donde [AS] es la concentración de A en la fase estacionaria, y [AM] la concentración de A en la fase móvil. Este modelo es análogo al utilizado en sistemas de extracción simple, si bien, la cromatografía es un sistema dinámico en el que los procesos de * En el extremo opuesto a la cromatografía de exclusión puede situarse la denominada cromatografía de

afinidad. En ésta, la fase estacionaria consiste en una especie bioactiva unida a un soporte sólido. La separación se produce en función de la afinidad química entre los diferentes solutos y el líquido bioactivo. Se utilizan interacciones altamente específicas, tales como las existentes entre un antígeno y un anticuerpo. El compuesto activo es retenido por la fase estacionaria, siendo eluidos los demás. Posteriormente, un cambio en el pH o en la composición de la fase móvil origina la liberación de la especie retenida, haciendo posible su elución.

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separación tienen lugar continuamente, con solutos moviéndose sobre la fase estacionaria y tratando de alcanzar el equilibrio definido por K. En cualquier caso, cuanto mayor sea el valor de K, mayor será la afinidad del componente en cuestión para la fase estacionaria y menor será la velocidad a la que se mueve a través del sistema. Para una muestra que contenga los componentes A, B y C, y que se introduzca como una banda estrecha sobre una fase estacionaria, si KA > KB > KC el componente A se desplazará a lo largo del sistema más lentamente que el B, y éste más despacio que el C. En cromatografía plana, los componentes A, B y C se ponen de manifiesto por la presencia de manchas, mientras que en cromatografía de gases o en HPLC, donde normalmente se utilizan métodos instrumentales como detectores a la salida de la columna en los que se monitoriza continuamente la composición de la fase móvil, la señal obtenida es proporcional a la cantidad de soluto presente en el eluyente, con lo que se obtienen picos más o menos Gaussianos, como los representados en la figura 10.7.(Los picos se ensanchan por una serie de causas que se considerarán posteriormente).

A BC

. A+B+C

.

A B C

COLUMNA

A

B

C

DETECTOR

Figura 10.7. Separación cromatográfica de una mezcla de tres compuestos.

RETENCION Y DISTRIBUCION El cromatograma simplificado representado en la figura 10.8 corresponde a una muestra que contiene un solo analito (A). El pico pequeño (B), corresponde a una especie no retenida por la columna y que a menudo está contenida en la muestra, pero que puede añadirse para facilitar la identificación de los picos*. En la misma figura se muestran algunos datos y símbolos característicos.

* En cromatografía de gases con detector de conductividad térmica suele inyectarse, junto con la muestra, unos micro-litros de aire,.

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tM: tiempo muerto (tiempo requerido para que una especie no retenida alcance el detector) VM : volumen muerto (volumen de fase móvil que se requiere para eluir una especie no retenida) tR: tiempo de retención (tiempo transcurrido desde la introducción de la muestra hasta que el componente alcanza el detector) VR : volumen de retención (volumen de fase móvil que se requiere para eluir un soluto de la columna cromatográfica) h: altura de pico; w: anchura de pico; w1/2: anchura de pico a la semialtura w0,1 : anchura de pico a un décimo de la altura.

Figura 10.8. Cromatograma: parámetros característicos.

Anteriormente se ha indicado que la mayor o menor retención de los componentes de una muestra por la fase estacionaria depende de las correspondientes afinidades. Estas, a su vez, dependen de diversos factores, entre los que cabe mencionar: * Interacciones electrostáticas entre especies de carga opuesta, como las que tienen lugar en separaciones por cromatografía iónica. * Interacciones por fuerzas de van der Waals del tipo dipolo-dipolo (orientación) o del tipo dipolo-dipolo inducido (inducción) * Interacciones por fuerzas de dispersión entre moléculas neutras o grupos funcionales. * Formación de enlaces de hidrógeno.

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El tiempo de retención puede considerarse que está constituido por dos componentes. Uno de ellos es el ya mencionado tiempo muerto, que es el mismo para todos los analitos en un sistema cromatográfico determinado, y el otro es el denominado tiempo de retención ajustado, t'R, que es el tiempo que realmente se invierte en la retención de un soluto por la fase estacionaria, y que se define como t'R = tR — tM Las características de retención de los componentes suelen describirse en la práctica por el factor de re...