Oxidaciones Biologicas INFORME DE PRACTICA PDF

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OXIDACIONES BIOLOGICASRELACIÓN DE EXPERIMENTOS: Xantino deshidrogenasa de la leche Oxidación del Lactato y succinato por un homogeneizado de músculo cardiaco OBJETIVOS: Estudiar la oxidación del Succinato y del Lactato por un homogeneizado de músculo cardiaco Estudiar la necesidad de cofactores y ac...

Description

OXIDACIONES BIOLOGICAS RELACIÓN DE EXPERIMENTOS: 1. Xantino deshidrogenasa de la leche 2. Oxidación del Lactato y succinato por un homogeneizado de músculo cardiaco OBJETIVOS: 1. Estudiar

la

oxidación

del

Succinato

y

del

Lactato

por

un

homogeneizado de músculo cardiaco 2. Estudiar la necesidad de cofactores y acción de inhibidores. 3. Estudiar la actividad de la xantina deshidrogenasa de la leche. INTRODUCCIÓN: Como es sabido, en la membrana mitocondrial interna existe una serie de transportadores de hidrógeno y/o electrones, que en conjunto se conocen como

cadena

respiratoria

mitocondrial.

Así,

diversos

sustratos

en

determinadas vías metabólicas, al oxidarse pierden 2 hidrógenos (2 protones y 2 electrones) por acción de deshidrogenasas ya sea NAD o FAD dependientes, estableciéndose desde aquí un verdadero proceso de transferencia de hidrógenos y/o electrones, dando como resultado final la reducción del oxígeno y su conversión en agua y la consecuente liberación de energía libre que es aprovechada en la formación de ATP.

En el esquema que presentamos, se observan los componentes de la cadena respiratoria mitocondrial de mamíferos. Se observan también algunos sustratos que al oxidarse, los protones y / o electrones perdidos

en estos

procesos son transportados por la cadena respiratoria. Así mismo, se muestra el sitio de acción de algunos inhibidores, lo mismo que los lugares donde se genera ATP. Está bien claro entonces que cuando funciona la cadena respiratoria mitocondrial, hay consumo de oxígeno. Así en presencia de mitocondrias y los sustratos adecuados, la medida del consumo de oxígeno es un índice del grado de funcionamiento de la cadena respiratoria mitocondrial. Sin embargo, la existencia de algunos compuestos que se comportan como aceptores artificiales de hidrógenos y/o electrones, hacen factible también el estudio de la oxidación de algunos sustratos oxidables por la cadena respiratoria mitocondrial. Entre los aceptores artificiales de electrones, se tiene al azul de metileno, matasulfato de fenazina, al diclorofenol indofenol, entre los más conocidos y que tienen la característica particular de presentar un color cuando están oxidados y otro cuando son reducidos por algún intermediario de la cadena respiratoria.

EXPERIMENTO Nº 1.

XANTINO DESHIDROGENASA DE LA LECHE. Rotular 4 tubos de ensayo y medir como se señala en el siguiente cuadro: TUBO Leche cruda

1 5.0 ml

2 ------

3 5.0 ml

4 5.0 ml

Leche hervida

------

5.0 ml

------

------

Uretano 50%

------

------

1.5 ml

------

Na CN 0.008 N

------

------

------

0.5 ml

Aldehído fórmico 0.1 M

0.8 ml

0.8 ml

0.8 ml

0.8 ml

Azul de metileno 0.001 M

0.4 ml

0.4 ml

0.4 ml

0.4 ml

a) Mezclar con cuidado cada uno de los tubos. b) Cubrir cada tubo con una capa de 1 ml. de parafina líquida (o aceite) y colocarlos en baño maría a 37ºC. c) Observar el grado de decoloración cada 5 min. EXPRESIÓN DE RESULTADOS: Observar el aclaramiento de los tubos cada 5 min. y anotarlo en cruces de acuerdo al siguiente esquema: -

Tubo permanece azul

+

Ligero aclaramiento

++

Aclaramiento mayor que el anterior

+++

Tubo casi completamente claro

++++ Tubo completamente claro TUBO Nº Tiempo 0 min. 9 Tiempo 5 min. Tiempo 10 min. Tiempo 15 min. Tiempo 20 min. Tiempo 30 min.

1 + +++

2 +

3 ++

4 + +++

++++ ++++ +++++

+ + ++

++ ++ ++

++++ ++++ +++++

Se puede utilizar más tiempo de lecturas si fuera necesario.

EXPERIENCIA Nª 2 OXIDACIÓN DEL LACTATO Y SUCCINATO POR UN HOMOGENIZADO DE MÚSCULO CARDIACO. Rotular 7 tubos de ensayo y medir lo siguiente. 1

2

3

4

5

6

7

Azul de metileno

3 gts.

3 gts.

3 gts.

3 gts.

3gts.

3 gts.

3gts.

Lactato 0.1 M Succinato 0.1 M

2 ml. ----

2ml. ----

-------

-------

---2 ml.

---2 ml.

-------

Succinato 0.3 M NAD

---0.1 ml. ---1.9 ml. 1.0 ml.

------

---0.1 ml. ---3.9 ml. 1.0 ml.

-------

-------

-------

2 ml. ----

---4.0 ml. 1.0 ml.

---2.0 ml. 1.0 ml.

2 ml. ----

2 ml. ----

1.0 ml.

1.0 ml.

6 -

7 +

-

+++

-

++

Malonato Agua destilada Preparación enzimática de músculo cardiaco

---2.0 ml. 1.0 ml.

Mezclar y añadir a cada tubo 1 ml. de parafina líquida (o aceite) Incubar en baño maría a 37ºC. EXPRESIÓN DE RESULTADOS: TUBO Nº Tiempo 0 min. Tiempo 5 min.

1 +++

2 -

3 -

4 -

Tiempo 10 min. Tiempo 15 min.

++

+

+

-

++++

-

+

-

5 +++

++++

Puede utilizarse más tiempo de lectura si fuese necesario.

INTERPRETACIÓN E INTERROGANTES BIOQUÍMICOS

1. Los potenciales redox de los sistemas A y B, son respectivamente, - 0.23 y 0.32 voltios, indicar cuál es el sistema oxidante y cuál es el reductor. -0.23 es un sistema redox que cede electrones. 0.32 en un sistema oxidante que quita electrones. 2. ¿Es necesario agregar NAD para que el lactato se oxide? Si __ No __ Qué tuvo apoya su respuesta: Si es necesario; El NAD puede ser fosforilado (NADP) y reducido (NADH y NADPH). El NAD funciona en las reacciones de oxidación-reducción (redox) y en las reacciones no-redox. La célula mantiene NAD en un estado ampliamente oxidado (NAD +) para que sirva como un agente oxidante en las reacciones catabólicas. 3. El lactato se ha oxidado en forma máxima en el tubo Nº ___. Explique qué es lo que ha sucedido en dicho tubo: En el tubo N° 1 y 5 por qué. El lactato es donador de electrones, agente reducido (trabaja con el complejo 1 y la coenzima NAD) 4. Por qué el aclaramiento del tubo 2 es menor que el del tubo 2. El azul de metileno, lactato, agua y preparado enzimático, pero no estala coenzima 5. ¿Hay aclaramiento en el tubo Nº 3? Si, No. ¿Por qué? No decolora porque no hay sustratos reducidos, no hay de donde obtener los electrones para que este se oxide. 6. ¿Hay aclaramiento en el tubo Nº 4? Si, No. ¿Por qué? No decolora porque solo tiene el azul de metileno, agua, preparado enzimático; actúa como el blanco porque hay presencia enzimática y el músculo cardíaco no sólo presenta esas sustancias o sustratos.

7. Cómo explica Ud. lo sucedido en el tubo Nº 5: No tiene lactato, pero si succinato (un agente reducido, trabaja con el complejo 2 y con el FAD) por esa razón tendrá cambio de color 8. Explique que pasó en el tubo Nº 6. se aclaró? Si ___ No ___. ¿Qué función está cumpliendo el malonato? Tiene presencia de malonato (inhibidor del complejo 2) esa es la razón por la que no se decolora. El malonato es un inhibidor de la respiración celular, porque se une al sitio activo de la succinato deshidrogenasa en el ciclo del ácido cítrico, pero no reacciona, compitiendo con el succinato. En la reacción de fosforilación oxidativa, el malonato es un inhibidor del complejo II que, nuevamente, contiene succinato deshidrogenasa 9. Qué objeto tiene el Nº 7: El malonato es un inhibidor competitivo, entre más cantidad tenga será mayor su inhibición. Pero si se aumenta la concentración del sustrato la inhibición puede ser vencida; esa es la principal razón por la que presentará una tenue decoloración. 10.¿De qué color aparecerán los tubos de no agregar la parafina? ¿Por qué? Estaría de color azul, solo crea condiciones anaeróbicas (Estados del agua en la cual la concentración de oxígeno disuelto es demasiado baja para permitir la existencia de bacterias aeróbicas.) 11. Escriba la reacción catalizada por la Xantino deshidrogenasa de la leche en el tubo Nº 1 La xantina deshidrogenasa pertenece al grupo de las enzimas que contienen molibdeno involucradas en el metabolismo oxidativo de las purinas. Esta enzima es un homodímero. La xantina deshidrogenasa puede ser convertida en xantina oxidasa por una oxidación reversible de un grupo sulfhidrilo, o por una modificación proteolítica irreversible. Esta enzima participa en el metabolismo de las purinas.

12. ¿Por qué el cianuro no inhibe la oxidación del aldehído fórmico en el tubo Nº 4? Porque el cianuro inhibe a la cadena respiratoria mitocondrial, bloqueando la transferencia de electrones del complejo citocroma oxidasa. No bloquea a las xantinas deshidrogenasas. La xantina deshidrogenasa no utiliza el cianuro de sodio (no interfiere en la reacción porque trabaja con el complejo 4) por esa razón la xantina deshidrogenasa se reduce al azul de metileno. 13.¿La Xantino deshidrogenasa es una enzima mitocondrial? Si __ No __. ¿Qué otras fuentes tisulares podrían usarse en esta experiencia? Sí, porque pertenece al grupo de las enzimas que contienen molifeno, molibdeno es un oligoelemento esencial para casi todas las formas de vida. Funciona como un cofactor para una seria de enzimas que catalizan importantes transformaciones químicas en el carbono global, nitrógeno, azufre y los ciclos de azufre.

14. ¿En el tubo Nº 3 observaría aclaramiento? Si __ No __. ¿Cuál sería la acción del uretano? Si, presenta aclaramiento, pero es parcial. El uretano no inhibe toda la enzima. Los uretanos, también conocidos como amidésteres, son una clase de compuestos que tienen en común el grupo carbamidato R–NH–C(=O)–O–R' y son, por lo tanto, formalmente derivados del ácido carbámico. Se forman fácilmente en la reacción del isocianato (R–N=C=O) correspondiente con el alcohol R'OH. 15. ¿Cuál es el sustrato natural de la Xantino deshidrogenasa y cuál es su rol fisiológico?

La xantino deshidrogenasa en química se conoce por su simbología XDH, se refiere a una enzima catalizadora de xantina, NAD+ y agua, obteniendo como productos NADH, urato y un hidrógeno. En otras palabras, se refiere a una enzima oxidativa que naturalmente se localiza en el hígado (sólo en estado patológicos cuando hay daño hepatocelular) y es liberada al torrente sanguíneo. Estas enzimas actúan a nivel del músculo liso, favorecen la vasodilatación y su rol fisiológico es actuar en la metabolización del ácido úrico...