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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA ESCUELA DE POSGRADO MAESTRÍA EN TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS

“PRÁCTICA DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS POR INSTRUMENTACIÓN: ESPECTROFOTOMETRIA”

DOCENTE: Edwin Baldeon

INTEGRANTES: Roberto Lazarte Bedoya Juan Carlos Oré Cuya Thomas Elías

LA MOLINA, Abril 2018

ESPECTROFOTOMETRIA I. INTRODUCCIÓN Las técnicas espectroscópicas se basan en los fenómenos de absorción y emisión de energía que tienen lugar en la interacción entre la radiación electromagnética y la materia. La determinación cuantitativa por espectrofotometría se basa en la ley combinada de Lambert-Beer, en el que se indica que en el caso de que se considere una radiación monocromática se verifica que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración de la especie responsable de la absorción. Esta relación se conoce como ley de Lambert-Beer. Esta ley presenta en ocasiones desviaciones de la linealidad. En algunos casos se trata de limitaciones inherentes a la ley conocida como desviaciones reales, mientras que en otros casos son desviaciones denominadas aparentes. 1 El experimento trata sobre la interrelación de la luz visible con el material a examinar con las condiciones de luz monocromática y de dilución de la muestra. Existen dos formas de llevar a cabo los espectros de absorción: manualmente, se lleva a cabo en un espectrofotómetro de haz simple, se coloca en una cubeta la solución y se va midiendo las absorbancias a distintas longitudes de onda. Automáticamente, se lleva a cabo en un espectrofotómetro de haz doble, en el que se sitúa la cubeta con el blanco en una de sus celdas y en la otra solución problema, se programa el aparato para que haga incidir distintas longitudes de onda y este hace el barrido. Los objetivos de la práctica fueron determinar la longitud de onda de máxima absorción para Azul de Metileno, realizar su curva de calibracion y determinar su coeficiete de extinción Molar. II. REVISIÓN DE LITERATURA De acuerdo a Bergmann y O'Konski (1963), la mayor absorbancia del azul de metileno en forma monomérica se alcanza a una longitud de onda de 664 nm. Según los autores Moreno A. y Bermejo R. (2014) indican que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración de la especie responsable de la absorción. Además de ello, indica que existen desviaciones de la linealidad. En algunos casos se trata de limitaciones inherentes a la ley conocidas como desviaciones reales, mientras que en 1 [ CITATION Gon15 \l 3082 ]

otros casos son desviaciones denominadas aparentes. En el primer caso, se hace referencia a las concentraciones altas (suele ocurrir con concentraciones de analito superiors a 0,01 M o con concentraciones altas de otras especies) aumentan las interacciones entre las moleculas de solute entre ellas o con el disolvente, con lo que se modifica la capacidad de las especies químicas para absorber la radiación. Otra causa que puede explicar estas desviaciones es la influencia de la concentración en el índice de refracción de la disolución analizada, lo que provoca una disminución en la capacidad de absorción. En el Segundo caso pueden ser debidas a procesos químicos en los que se ve involucrado el analito, o bien a las características del Sistema instrumental con el que se lleva a cabo la medición.

Algunos antecedentes investigativos son mencionados a continuación -

Estudio por Espectrofotometria UV-VIS de la Hetero-Asociación de la Teofilina con el Azul De Metileno (2010)

-

Estudio de la Remoción del Colorante Azul de Metileno Empleando la Biomasa de la Morinda Citrocifolia L. (2011)

-

Degradación del Azul de metileno Y verde de Malaquita por Fotocatálisis Heterogénea Utilizando Dióxido de Titanio Dopado con Nitrógeno (N-Tio2) Bajo Luz Visible (2015)

-

Degradación de Colorantes (Azul De Metileno) por Reacción de Fenton Electroquímico (2015)

-

Degradación de Azul d Metileno Y 4- Clorofenol por Fotocatálisis con Luz Ultravioleta, Utilizando TiO2 Como Catalizador (2010)

III. MATERIALES Y MÉTODOS A) LOCACIÓN

El experimento fue ejecutado en el Laboratorio de Bioquímica de la Universidad Nacional Agraria La Molina. Dado que el Azul de Metileno tiene gran poder de tinción, además del mandil, se tuvo que contar con alcohol y guantes para evitar manchas. Hasta cierto punto la mayor dificultad fue el pesado y hacer las concentraciones adecuadas para efectuar las medidas de absorción.

B) MATERIALES USADOS - Azul de Metileno (Imagen 1) - Agua destilada. - Pipetas de 1, 2 , 5 y 10 ml - Propipetas. - Pizeta - Fiolas de 50, 100 y 1000 ml - Papel Tisue y Alcohol. (secado y limpieza). - Cubetas de espectrofotómetro - Espectrofotómetro (imagen. 2) - Balanza analítica (Imagen 3)

Imagen. 1. Soluciones de Azul de Metileno

Imagen. 2. Espectrofotómetro UNICO-UV2100

Imagen 3. Balanza analítica AND-SHS

C) MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS Determinación de Longitud de Onda (λ) de Máxima Absorbancia - Se realizaron 15 lecturas de Absorbancia (ABS) cada 20 nanómetros (nm) en un rango de Longitud de onda (λ) Comprendido entre 400 a 700 nm. - Se utilizó 1.5mg de azul de metileno (C 16H18ClN3S) diluido 1Lt De agua destilada como muestra absorbente. (figura. 1) - Fueron un total de 4 repeticiones para cada λ, repetición 1 y 2 fueron preparas con 2 días de anticipación y repetición 3 y 4 con una muestra prepara en el instante de la medición.

+ 1 Litro H2O Destilada

=

Figura 1. Preparación de Solución Madre

Curva de Calibración - Las mediciones de ABS se hicieron por triplicado a partir de la misma solución madre, variando el individuo encargado de la disolución y medición; la curva de calibración se realizó con el promedio de los resultados - se realizaron diluciones, a partir de una solución madre 0.625 mM, siguiendo la ecuación presentada a continuación; los cálculos se encuentran detallados en el ANEXO 1

C1 V 1=C 2 V 2 En donde: C1 = concentración de la solución madre V1 = volumen de la solución madre a adicionar C2 = concentración de la solución que se desea obtener V2 = volumen de la fiola a enrazar

Coeficiente de Extinción Molar - La tercera y última parte consta del cálculo del Coeficiente de Extinción molar, con los resultados obtenidos; Los cálculos se encuentran detallados en el ANEXO 2. La ecuación es: A=Ɛ x b x C

Ɛ=

A b xC

En donde: A = Absorbancia Total media Ɛ = Coeficiente de Extinción Molar b =Recorrido óptico C =Concentración Molar de la especia absorbente

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Determinación de Longitud de Onda (λ) de Máxima Absorbancia La práctica presentó dificultades al momento de realizar la serie de diluciones. En primera instancia se preparó una solución madre 20 mM y la serie de diluciones fue 10, 5, 2.5, 1.25 y 0.625 mM (Imagen 4) Cuando se realizó la medición de la muestra más diluida el espectrofotómetro arrojaba valores de Absorbancia totalmente desviados, por lo que se realizaron diluciones a concentraciones inferiores según se detalla en la práctica, a partir de la solución más diluida de la primera serie de diluciones. El valor de Longitud de onda de máxima absorción se determinó a 660nm, valor que se asemejan a lo reportado por Arenas y López (2004)2 y por Muñoz y Adame. (2016)3

2 [ CITATION Are04 \l 3082 3 [ CITATION Muñ16 \l 308

Imagen 4. Preparación de primera serie de diluciones

Tal como se aprecia en el siguiente cuadro, el coeficiente de variación (CV) de las repeticiones evidencia la poca confiabilidad y presentación de la media; Esto se debe a que las repeticiones fueron realizadas por diferentes individuos y a partir de soluciones preparadas

en

momentos

diferentes

según

lo

explicado

en

METODOS

PROCESAMIENTOS CUADRO 1: ABS DE AZUL DE METILENO EN UN RANGO DE λ ENTRE 400 A 700NM ƛ (nm) 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700

rep. 1 0.010 0.005 0.007 0.016 0.022 0.026 0.029 0.043 0.076 0.133 0.234 0.298 0.375 0.528 0.283 0.042

ABSORBANCIA (ABS) rep. 2 rep. 3 rep. 4 0.007 0.027 0.024 0.005 0.017 0.018 0.007 0.019 0.020 0.016 0.027 0.028 0.019 0.033 0.035 0.027 0.039 0.040 0.030 0.040 0.043 0.043 0.056 0.060 0.077 0.097 0.102 0.133 0.161 0.174 0.233 0.278 0.307 0.292 0.353 0.309 0.374 0.447 0.493 0.530 0.620 0.681 0.284 0.341 0.371 0.042 0.063 0.066

PROM 0.017 0.011 0.013 0.022 0.027 0.033 0.036 0.051 0.088 0.150 0.263 0.313 0.422 0.590 0.320 0.053

ESTADÍSTICA CV Varianza DE 0.000231 0.015 89% 0.000135 0.012 103% 0.000135 0.012 88% 0.000114 0.011 49% 0.000167 0.013 47% 0.000146 0.012 37% 0.000136 0.012 33% 0.000213 0.015 29% 0.000488 0.022 25% 0.001198 0.035 23% 0.003752 0.061 23% 0.001215 0.035 11% 0.009770 0.099 23% 0.016015 0.127 21% 0.005406 0.074 23% 0.000447 0.021 40%

GRAFICA 1: CURVA PARA λ DE MÁXIMA ABSORCIÓN

Y

ABS PROM

Longitud de onda (λ)

Curva de Calibración La curva de calibración realizada a partir de la muestra más diluida de la primera serie de diluciones (0.625mM) nos indica que un factor de desviación de la ley de Lambert-Beer, aparte del límite de concentración para soluciones (10 mM), es la naturaleza de la muestra absorbente, en este caso el azul de metileno. Así mismo, con el valor de r 2 = 0.99se comprueba la linealidad de la curva de calibración propuesta por esta Ley. Al igual que en la determinación de la longitud de onda de máxima absorción, se puede apreciar que el coeficiente de variación (CV) tiene valores superiores a 14%, lo que significa que la media no es representativa, este es consecuencia de a que las repeticiones fueron realizadas por distintos individuos. CUADRO 2: ABS DE AZUL DE METILENO A DIFERENTES CONCENTRACIONES Molariad (mM) 0.0045 0.0030 0.0015 0.0010 0.0005

ABSORBANCIA (ABS) Rep 1 Rep 2 Rep 3 1.143 1.157 1.05 0.834 0.84 0.65 0.418 0.428 0.259 0.38 0.377 0.283 0.162 0.159 0.13

PROM 1.11666667 0.77466667 0.36833333 0.34666667 0.15033333

ESTADÍSTICA Varianza DE 0.005680 0.075 0.020485 0.143 0.015607 0.125 0.005471 0.074 0.000575 0.024

CV 7% 18% 34% 21% 16%

GRAFICA 2: CURVA DE CALIBRACIÓN

ABS PROM

Concentración (mM)

Coeficiente de Extinción Molar Este coeficiente es el parámetro que define la absorbancia de la luz de un compuesto a una longitud de onda determinada, por su concentración; Entonces este valor dependerá del tipo de la muestra absorbente y de la longitud de onda utilizada, diferentes compuestos presentaran valores diferentes. Este coeficiente permite la ¨Fuerza¨ con la que un compuesto absorbe la REM a distintas concentraciones. El autor Cenens, J (1988)4 establece este coeficiente para el azul de metileno a 664 nm en 3166.66 L.mol-1.cm-1; lo que refleja una similitud al valor calculado en la práctica.

CUADRO 3: Coeficiente de Extinción Molar (Ɛ) CONCENTRACIÓN mM 0.0045 0.0030 0.0015 0.0010 0.0005 4 [ CITATION Cen88 \l 3082 ]

Ɛ660 Azul de Metileno (L.mol-1.cm-1) 248148.148 258222.222 245555.556 346666.667 300666.667 nm

M 4.5x10-6 3.0 x10-6 1.5 x10-6 1.0 x10-6 0.5 x10-6

279851.852

PROM

Bibliográficamente se tiene valores de coeficiente de extinción molar para compuestos diversos, en donde se puede observar la similitud de alguno de los compuestos con el azul de metileno, tales como Ac. Linoleico (cis-trans) y Colesterol,

CUADRO 4: Coeficiente de Extinción Molar (Ɛ) de Compuestos varios

COMPUESTO

LONGITUD DE ONDA (nm)

NADH FAD Caroteno Ac. Linoleico (trans-trans) Ac. Linoleico (cis-trans) Triptofano Tirosina

Fenilalanina DNA RBA Colesterol Fuente: Arenas y López (2004)5

5 [ CITATION Are04 \l 3082 ]

260 340 260 375 445 450 231 234 280 219 274 22 193 257 206 188 258 258 235

COEFICIENTE DE EXTINCION MOLAR (L.m-1cm-1) 1500 6200 15000 9000 1000 12000 35000 24500 5600 47000 1400 8000 48000 200 9300 60000 6600 7400 20000

V. -

CONCLUSIONES La determinación de Longitud de onda de máxima absorción no está relacionada a la concentración de la muestra, es decir 2 soluciones de una muestra de diferentes concentraciones permiten calcular la longitud de onda máxima de la muestra absorbente

-

Se determinó que la longitud de onda de máxima absorción para el azul de metileno es de 660 nm.

-

La concentración es directamente proporcional a la absorbancia

-

Se cumple una tendencia linean en la curva de calibración (r2=0.99)

-

La Ley de Lambert-Beer se desvía, no solamente por la concentración de la solución, sino que también depende de la naturaleza de la muestra absorbente.

-

Con la curva de calibración es posible determinar la Concentración de cualquier solución de azul de metileno, por medio de la Absorbancia de esta y la ecuación de la curva de calibración; La precisión de los datos dependerá de cuan cerca de 1 se encuentre el r2 de la recta

-

Muestras preparadas en distintos momentos pueden presentar variación en la lectura de resultados de Absorbancia, así como la variación del individuo encargado de la medición o preparación de la solución.

VI.

BIBLIOGRAFÍA

Arenas, I., & Lopez, J. (2004). ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN. Morelia. Cenens, J. (1988). Espectroscopia Visible del Azul de Metileno. Gonzales, M. (2015). La espectroscopia y su tecnología: Un repaso histórico y su importancia para el siglo XXI. Mexico. Muñoz, A., & Adame, R. (2016). Determinación del valor de sorción de azul de metileno para fillers mediante la técnica de espectrofotometría visible. Temuco.

ANEXOS

ANEXO 1: Cálculos para preparación de diluciones

C1 V 1=C 2 V 2 0.625 nM x V 1=0.0045 mM x 100 ml

V 1=0.720 ml para una solucion 0.0045 mM

C1 V 1=C 2 V 2

0.625 nM x V 1=0.0030 mM x 100 ml V 1=0.480 ml para una solucion 0.0030 mM

C1 V 1=C 2 V 2 0.625 nM x V 1=0.0015 mM x 100 ml

V 1=0.240 ml para una solucion 0.015 mM

C1 V 1=C 2 V 2

0.625 nM x V 1=0.0010 mM x 100 ml V 1=0.160 ml para una solucion 0.010 mM

C1 V 1=C 2 V 2 0.625 nM x V 1=0.0005 mM x 100 ml

V 1=0.080 ml para una solucion 0.0005 mM

ANEXO 2: C cálculos para determinación del coeficiente de Extinción Molar de Azul de Metileno

Ɛ=

1.11666667 −6 1 cm x 4.5 x 10

Ɛ =¿ 248148.148 L mol-1 cm-1

Ɛ=

0.77466667 1 cm x 3.0 x 10−6

Ɛ =¿ 258222.2222 L mol-1 cm-1

Ɛ=

0.36833333 1 cm x 1.5 x 10−6

Ɛ =¿ 245555.5556 L mol-1 cm-1

Ɛ=

0.34666667 1 cm x 1.0 x 10−6

Ɛ =¿ 346666.6667 L mol-1 cm-1

Ɛ=

0.15033333 1 cm x 0.5 x 10−6

Ɛ =¿ 300666.6667 L mol-1 cm-1...