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Aula 1: Introdução às operações unitárias em biosseparações

Clarificar  Isolar  Purificar  Polimerizar Purificação – 4 etapas genéricas: 1. Clarificação: Separação das células e seus fragmentos do meio; Remoção de sólidos suspensos, reduz a turbidez do meio. Pode ser feita por: centrifugação, filtração, filtração tangencial, floculação. 2. Isolamento:

Concentração

ou

Rompimento celular quando

purificação

de

o produto está

baixa

resolução;

dentro da

célula

(homogeinização, ultra-som, moinho de bolas, rompimento químico ou enzimático) o Maior ganho de concentração 3. Purificação - De baixa resolução: Separação de moléculas com propriedades físico-químico muito diferentes; - De alta resolução: Separação de moléculas com propriedades físico-químico semelhantes; o Maior ganho de qualidade 4. Polimento:

Acondicionamento

final

do

produto.

Operações

cromatográficas ou simples concentração do meio. Ex. processos: Produção de ácido cítrico, produção de enzima intracelular, produção de antibiótico...

Como escolher as operações unitárias para cada etapa do processo? A definição do processo de purificação, seu número e sequência de etapas, depende da aplicação da molécula-alvo (nível de pureza requerido), suas características físico-químicas e das características das impurezas. Ex.1: Produtos que não requerem alto grau de pureza, como ácidos orgânicos e enzimas industriais: processamento em poucas etapas, como clarificação e concentração.

Ex.2: Produtos que requerem alto grau de pureza, como produtos farmacêuticos:

processamento

em

muitas

etapas,

como

clarificação,

purificação de baixa e alta resolução.

Enzimas industriais são produzidas em grandes volumes e usadas em grandes quantidades, podem ter pureza 95%, e serem livres de contaminantes como príons, LPS, vírus e proteínas do hospedeiro; assim, os custos, número de passos, tempo de processamento e rendimento tornam-se secundários com relação à pureza.

Como reduzir custos e perda molécula-alvo para tornar o processo viável? 

Reduzir o número de etapas;



Otimizar ordem das etapas;



Combinar diferentes finalidades em uma única etapa;



Limitar grau de pureza necessário à aplicação da molécula-alvo;



Introduzir modificações genéticas no organismo produtor para facilitar as etapas de purificação.

Aula 1b. Rompimento celular

Considerar: tamanho da célula, tolerância a tensões de cisalhamento, necessidade de controle de temperatura, custo e rendimento do processo. Células envolvidas só por membranas, como as células animais, são frágeis e podem ser rompidas sob baixas tensões, por variação da pressão osmótica, adição de detergentes ou aplicação de ultra-som. Já as células com parece celular robusta, como as microbianas, dificultam o rompimento. As bactérias gram-positivas possuem paredes celulares ainda mais rígidas.

A parede celular pode ser completamente rompida ou apenas o suficiente para liberar a molécula alvo. Após isso, os compostos indesejados devem ser removidos por filtração, centrifugação, precipitação ou extração líquido-líquido.

Métodos de ruptura: 

Mecânicos o Homogeneizador de alta pressão o Moinhos de bolas o Prensa French o Ultra-som



Físicos o Choque osmótico o Congelamento e descongelamento o Aquecimento



Químicos o Álcalis o Ácidos o Solventes o Detergentes



Enzimáticos o Lise enzimática o Inibição da síntese da parede celular

Para definir o tempo de operação: Monitorar o número de células intactas Monitorar a liberação de proteínas

Rompimento mecânico – Homogeneizador de alta pressão (prensa francesa)



Vantagens: Efetivo contra múltiplos organismos; Excelente para aumento de escala; Permite operar com grandes volumes.



Desvantagens: Precisa trabalhar com alta pressão; Pode precisar de múltiplas passagens para ter alta eficiência; Pode apresentar problemas de vazamento.

Pistões projetados para aplicações a altas pressões forçam a passagem da suspensão celular por um orifício estreito seguida da colisão com uma superfície rígida e imóvel em uma câmera a alta pressão. A redução instantânea da pressão e o impacto provocam o rompimento celular sem danificar as células. Porém, esse rompimento causa aumento da temperatura do meio, de modo que o equipamento deve ter um sistema de refrigeração. Indicado para células de bactérias e leveduras, mas não para fungos filamentosos, pois eles bloqueiam a válvula de descarga. A quantidade de células rompidas é proporcional à pressão de alimentação. Para aumentar a eficiência, pode-se recircular o material (maior custo, risco de degradar a molécula x obtenção de fragmentos menores). As condições de cisalhamento influenciam a eficiência.

Rompimento mecânico – Moinho de bolas Constitui-se de uma câmera cilíndrica fechada com um sistema de refrigeraão e um eixo que gira em alta rotação. A câmera recebe as esferas de vidro e as células em suspensão. Ao longo do eixo, estão distribuídos discos ou hastes que giram em alta velocidade provocando o atrito entre as esferas e as células, que causa o rompimento celular.

A eficiência depende: I)

da geometria da câmera (horizontal – mais eficiente);

II)

da velocidade (mais rápido, mais rompimento);

III)

do tipo de agitador (o que transferir mais energia é mais eficiente);

IV)

do tamanho das esferas (menor diâmetro, melhor eficiência);

V)

da carga das esferas (carga muito pequena não proporciona colisão, carga muito grande faz as esferas colidirem umas com as outras; tamanho deve ocupar de 80-85% do volume da câmera horizontal e 50-60% da câmera vertical);

VI)

da concentração celular (30-50% do volume da câmera);

VII)

da velocidade de alimentação (a fração de células rompidas diminui com o fluxo de alimentação, pois o aumento deste reduz o tempo de residência no rompedor);

VIII)

da temperatura (deve ser de 5-15ºC)

Indicado para romper: bactérias, leveduras e fungos filamentosos. 

Vantagens: Efetivo contra múltiplos organismos; Excelente para aumento de escala; Alta eficiência; Processa altas concentrações celulares; Condições de rompimento são facilmente controláveis.



Desvantagens: Atrito das esferas gera calor; Pode ocorrer degradação de produtos sensíveis ao cisalhamento.

Rompimento mecânico – Ultra-som

Ondas sonoras são convertidas em vibrações em um meio líquido, gerando bolhas pequenas, as quais entram em colapso com o passar do tempo, gerando impacto e rompimento celular. Método muito utilizado em escala de laboratório e inviável em grande escala. A energia ultra-sônica é gerada por um aparelho chamado sonicador e transmitida por uma sonda. O aumento da temperatura deve ser controlado. Uso de diferentes diâmetros de onda para diferentes volumes de trabalho. 

Vantagens: Efetivo contra múltiplos organismos; Simples de operar; Eficiente e rápido; Permite trabalhar com pequenos volumes.



Desvantagens: Gera grande quantidade de calor; Pode ocorrer desnaturação do produto; Opera apenas com baixas concentrações celulares; Não é possível aumento de escala.

Rompimento físico – Choque osmótico Rompimento celular em meio com alta concentração osmótica. O choque não rompe

as células integralmente, mas

propicia uma

permeabilidade seletiva, em que algumas proteínas podem ser liberadas para fora da célula. Indicado em especial para gram-negativas (parede celular mais sensível). 

Vantangens: Reduz a quantidade de contaminantes que devem ser

retirados em técnicas posteriores.

Rompimento físico – Congelamento / descongelamento A célula é submetida a repetidos ciclos de congelamento e descongelamento, o que gera a formação de cristais de gelo que a perfuram e liberam a molécula alvo. Indicado para rompimento de patógenos. Não indicado para a obtenção de biomoléculas sensíveis.

Rompimento físico – Aquecimento (termólise) A suspensão celular é aquecida em banho termostatizado com injeção de vapor direto. Ampla utilização em larga escala para rompimento de algas, fungos filamentosos, leveduras e bactérias.

Rompimento químico – Álcalis Amônia e hidróxido de sódio Recomendável quando a biomolécula alvo é estável a pH básico. Geram poluentes. Ajusta-se o pH básico e depois de um tempo, reduz-se o pH para ácido e centrifuga-se o homogeinizado.

Rompimento químico – Detergentes Dissociam proteínas e lipoproteínas das paredes celulares, provocando poros (ou rompendo toda a camada), por onde a molécula alvo é liberada. 

Limitações: proteínas.

Podem formar espumas que desnaturam as

Rompimento químico – Solventes Solventes, tais como etanol, metanol, acetona, podem ser empregados como desidratantes químicos das células.

Rompimento enzimático – Lise enzimática Enzimas podem hidrolisar as paredes de células microbianas, liberando as moléculas de interesse. Útil quando a molécula alvo é sensível a temperatura, tensão de cisalhamento e pressão dos métodos mecânicos. Considerar: se há presença de inibidores, se pode-se fazer reciclo da enzima, se há resistência da enzima ao tratamento mecânico (caso os tratamentos sejam associados); pH, temperatura, concentração celular. 

Vantagem:

Alta especificidade Associação com outros métodos



Desvantagem:

Custo da enzima Variação

do

estado

fisiológico

do

microrganismo interfere na eficiência do rompimento. Inibidores de proteases devem ser adicionados para impedir a degradação da molécula alvo. A liberação de ácidos nucleicos e proteínas estruturais aumentam a viscosidade do mei o, por isso, adicionar nucleases e proteases, e alterar o pH pode melhorar as características do meio, desde que não destruam a molécula de interesse.

Aula 2. Filtração e centrifugação

A separação das células costuma ser a primeira operação unitária na purificação. Centrifugação + Filtração + Separação por membranas  Clarificado

Filtração Em geral, aplica-se a: 

Grandes volumes de suspensões diluídas de células



Produtos extracelulares



Quando assepsia não é necessária, não tem como ser asséptico;



Separação de fungos filamentosos, pois sua densidade próxima ao meio líquido torna difícil centrifugar.

Filtração industrial x Equipamento laboratorial  Princípio é o mesmo, mudando apenas a quantidade de material a ser filtrado. Filtro de Büchner – aparelho laboratorial mais comum. Uso da ação da gravidade e um tecido poroso. Uso de vãos Kitasato conectado a uma bomba de vácudo devido ao aumento da resistência com a passagem do líquido. Auxiliares de filtração Usado principalmente para bactérias e leveduras (ou então, usa-se centrifugação). Material sólido muito poroso cuja aglomeração não impede tanto a passagem de líquido. Utilizado para reduzir a compressibilidade da torta de filtração. 

Reduzem a compressibilidade da torta de filtração, aumentando a permeabilidade do meio;



Pode ser agregado à suspensão inicial, ou depositado na forma de fina camada sobre o meio filtrante;



Ocorre adsorção das células, diminuindo a compressibilidade da torta, evitando o entupimento do filtro;



Pode reduzir o tempo de filtração na ordem de 5 a 20 vezes.

Limitações de uso

 Quando há adsorção irreversível da molécula alvo sobre o auxiliar  Quando o produto é intracelular, pois o auxiliar inviabiliza a etapa posterior de rompimento celular, células ficam agregadas aos auxiliares.  Apesar da redução em s, a viscosidade é aumentada, aumentando o tempo de filtração Ex.: terra diatomácea, perlita. A permeabilidade do leito depende de... 

Acúmulo da torta



Material da torta



Material a ser filtrado



Área da filtração.

A resistência do meio de filtração é dada pela força necessária para filtrar x força de resistência. Uma torta pode ser compressível (p.ex.: torta de células) ou incompressível (p.ex.: torta de cristais).

Incremento da força da ação da gravidade (Fc)

Fc = 1.12 x R x (RPM/1000)² (R em mm) *Sempre mencionar o valor de Fc e o tempo em uma centrifugação Fc = 20-30xg  Suficiente para aumentar 1000x a velocidade de sedimentação Fc=2000xg  Sedimentação de leveduras Fc=5000xg  Sedimentação de bactérias

Transferência – Escala laboratorial para escala industrial Fc1.t1 = Fc2.t2

Centrifugação ( - Clarificação) As células em suspensão sedimentam-se por ação da gravidade. A centrifugação é influenciada basicamente pela densidade do material. Implemento à força gravitacional para acelerar a sedimentação. Proporcional à velocidade de giro, raio da centrífuga e força gravitacional. Muito utilizada para bactérias e leveduras. Quanto maior o raio, menor a força necessária. 

Protocolos não devem ter unidade em rpm, mas sim em lm g, pois em rpm não se considera o efeito das modificações do raio da centrifuga. Converter!

Centrífugas 

Centrífugas tubulares o Podem operar sob refrigeração o Altos valores de Fc (13-17 mil xg) o Capacidade limitada o Operação descontínua o Suspensões de no máximo 30g/L de células o Eixo vertical o Partículas pesadas vão para a parede do tubo; separação de “leve” e “pesado”.



Centrífugas de discos o Fc de 5-15mil xg o Rotação um pouco mais baixa o Operação contínua de até 200m³/h o Maior área de sedimentação, requerendo menor tempo o Aumenta a área superficial, permite separações de fase

o Suspensões de no máximo 250 g/L de células o Suspensões com maiores concentrações

Auxiliares de centrifugação Podem ajudar na agregação das células com base em suas características de superfície. 

Induzir a coagulação; o Aumenta a dimensão e densidade dos sólidos suspensos, aumentando a velocidade de centrifugação.



Ajuste de pH (reduzir carga superficial das células resulta em partículas maiores e mais densas);



Adição de eletrólitos (reduz repulsão eletrostática entre as partículas);



Sais polivalentes;



Moléculas sintéticas.

Aula 3. Processos de separação por membranas (PSM)

Muitas vezes, os produtos desejados obtidos dos mostos fermentados encontram-se em baixas concentrações, e juntamente com sólidos suspensos ou coloidais, fragmentos de microrganismos e celulares, produtos metabólicos, etc, além dos nutrientes do meio. Os PSM visam separam essas substâncias, cujas dimensões variam de nm para mm. -- Recuperação de células; obtenção do mosto clarificado

Usos:  Clarificação da amostra  Processamento de substâncias lábeis e sensíveis à temperatura, pH, força iônica, solventes e tensões cisalhantes

 Filtração de gases, não para esterilizar, mas apenas para separar dois ou mais gases.  Esterilização contínua do meio de cultura e do ar na alimentação, remoção de produtos nos biorreatores  Permite à reação e à separação ocorrerem simultaneamente. Vantagens:  Baixo consumo energético, pois não aquece ou esfria  Não gera resíduo  Seletividade pelo tamanho dos poros  Fácil ampliação de escala  Separação de termolábeis  Operação simples  Eliminam custos de armazenamento e tratamento auxiliar de filtração

As membranas podem ser 

Porosas

Parâmetros: distribuição dos poros, porosidade superficial e espessura, a filtração depende do tamanho do poro e das espécies presentes. Processos: microfiltração, ultrafiltração, nanofiltração, diálise 

Densas

Parâmetros: características físico-químicas do polímero utilizado e espessura do filme polimérico, de modo que a filtração depende da afinidade das diferentes espécies com o material da membrana e na difusão dessas pelo filme polimérico. Processos: osmose inversa, pervaporação, permeação de gases

Filtração tangencial A solução de alimentação escoa em paralelo à superfície da membrana, o permeado é transportado transversalmente a esta.

Melhor polarização do que na filtração convencional. Efeito reduzido com o aumento da velocidade de escoamento da alimentação. Filtração convencional

x

Acumula torta.

Filtração tangencial (fluxo cruzado) Filtro paralelo à membrana. Ocorre acúmulo

de material, não forma torta.

Fibra oca  Pode ser fluxo contínuo  Variar a espessura das fibras permite aumentar a área de filtração, de acordo com o volume do módulo.

Geometria de membranas e tipos de módulos 

Membranas com geometria plana o Módulo tipo placa e quadro o Módulo tipo espiral



Membranas com geometria cilíndrica

Modos de operação em sistemas com membranas 

Operação em processo descontínuo o Células de filtração em bancada



Operação em processo semicontínuo o Equipamento piloto de membrana o Concentra a solução, pois esta é bombeada várias vezes para ser filtrada.



Operação em processo contínuo o Sistema de membrana em cascata o Sistema de membrana com reciclo do permeado o Permite filtrar por mais tempo o Pode ser feito com recirculação do permeado o É modular

Tipos de processos Todos trabalham com diferença de pressão. Quanto menor o tamanho do poro, maior a pressão. Membranas

com

diferentes

características

podem

ser

empregadas,

caracterizando os seguintes processos: 

Microfiltração

-

Menor resistência à TM

o Uso de membranas microporosas, isotrópicas ou anisotrópicas o Retém partículas em suspensão o Passam: água, sais, moléculas de massa molecular média, macromoléculas o Aplicação: esterilização bacteriana, concentração de células, oxigenação de sangue o Separação sólido-líquido o Permite filtração convencional o Filtração de microrganismos 

Ultrafiltração

o Uso de membranas microporosas anisotrópicas o Passam: água, sais, moléculas de massa molecular média o Aplicação:

fracionamento

e

concentração

de

proteínas,

recuperação de óleos o Moléculas extracelulares secretadas; o Acúmulo de macromoléculas 

Nanofiltração o Uso de membranas microporosas anisotrópicas o Passam: água, sais o Aplicação:

purificação

de

enzimas,

concentração

de

biomoléculas, biorreatores à membrana, obtenção de água potável, concentração de antibióticos 

Hiperfiltração (osmose inversa) -

Maior resistência à TM

o Uso de membranas anisotrópicas densas, permeáveis apenas ao solvente o Passa: água o Aplicação: dessalinização de águas, concentração de antibióticos, desmineralização de águas o Aplica pressão maior do que a pressão osmótica na soluç...