PENAPISAN DAN ANALISIS KUALITATIF PDF

Preview

Summary

PENAPISAN DAN ANALISIS KUALITATIF SENYAWA METABOLIT SEKUNDER I. Tujuan Melakukan penapisan senyawa metabolit sekunder dengan analisis kualitatif II. Landasan teori Uji penapisan untuk menapis dan mengenali golongan senyawa (analit) dalam sampel. Disini analit digolongkan berdasarkan baik sifat fisik...

Description

PENAPISAN DAN ANALISIS KUALITATIF SENYAWA METABOLIT SEKUNDER

I.

Tujuan Melakukan penapisan senyawa metabolit sekunder dengan analisis kualitatif

II.

Landasan teori Uji penapisan untuk menapis dan mengenali golongan senyawa (analit) dalam sampel. Disini analit digolongkan berdasarkan baik sifat fisikokimia,

sifat

kimia

maupun

efek

farmakologi

yang

ditimbulkan.Obat narkotika dan psikotropika secara umum dalam uji penapisan

dikelompokkan

menjadi

golongan

opiat,

kokain,kannabinoid, turunan amfetamin, turunan benzodiazepin, golongan

senyawa

anti

dipresan

tr

i-siklik,

turunan

asam

barbiturat,turunan metadon. Pengelompokan ini berdasarkan struktur inti molekulnya. Sebagai contoh, disini diambil senyawa golongan opiat, dimana senyawa ini memiliki struktur dasar morfin, beberapa senyawa yang memiliki struktur dasar morfin seperti, heroin, monoasetil morfin, morfin, morfin-3-glukuronida, morfin-6-glukuronida, asetilkodein,

kodein,

kodein-6-glukuronida,

dihidrokodein

serta

metabolitnya, serta senyawa turunan opiat lainnya yang mempunyai inti morfin. Uji penapisan seharusnya dapat mengidentifikasi golongan analit dengan derajat reabilitas dan sensitifitas yang tinggi, relatif murah dan pelaksanaannya relatif cepat. Terdapat teknik uji penapisan yaitu: a) kromatografi lapis tipis (KLT) yang dikombinasikan dengan reaksi warna, b) teknik immunoassay.

Teknik immunoassay

umumnya memiliki sifat reabilitas dan sensitifitas yang tinggi, serta dalam pengerjaannya memerlukan waktu yang relatif singkat, namun alat dan bahan dari teknik ini semuanya harus diimpor, sehingga teknik ini menjadi relatif tidak murah. Dibandingkan dengan

1

immunoassay, KLT relatif lebih murah, namun dalam pengerjaannya memerlukan waktu yang relatif lebih lama (Made Agus Gelgel Wirasuta,2008:4-50) Tumbuhan

secara

alamiah

menghasilkan

beragam

jenis

senyawa. Secara umum, senyawa-senyawa tersebut dapat dibagi tiga, yaitu metabolit primer, polimer, dan metabolit sekunder. Metabolit primer adalah senyawa-senyawa yang terdapat pada semua sel dan memegang peranan sentral dalam metabolisme dan reproduksi sel-sel tersebut. Contoh metabolit primer antara lain asam nukleat, asam amino, dan gula. Polimer adalah senyawa penyusun sel yang terdiri dari senyawa yang memiliki berat molekul yang tinggi, seperti selulosa, lignin, dan protein. Metabolit sekunder adalah senyawa yang secara khusus terdapat pada jenis atau spesies tertentu saja. Berbeda dengan senyawa metabolit primer yang pada umumnya memberi pengaruh biologi terhadap sel atau organisme tanaman itu sendiri, metabolit sekunder (MS) memberikan pengaruh biologi terhadap sel atau organisme lain. Ada beberapa cara klasifikasi bisa dibuat, seperti berdasarkan sifat struktur, asal-usul biosintesis, atau lainnya. Berdasarkan sifat strukturnya,MS dibagi ke dalam 6 golongan, yaitu 1) poliketida dan asam lemak, 2) terpenoid dan steroid, 3) fenilpropanoid, 4) alkaloid, 5) asam amino khusus dan peptida, dan 6) karbohidrat khusus.

(Hanson, 2011) Senyawa metabolit sekunder banyak sekali jumlahnya. ada lebih dari 200000 struktur produk alamiah atau produk metabolit sekunder. Untuk memudahkan, perlu dibuat klasifikasi. Berdasarkan asal-usul biosintesisnya,MS dibagi menjadi empat kelompok, yaitu 1) alkaloid, 2) fenilpropanoid, 3) poliketida, dan 4) terpenoid (Springob dan Kutchan,2009) Berdasarkan kandungan MS dibagi ke dalam dua kelompok besar, yaitu1) MS yang mengandung N dan 2) MS yang tidak

2

mengandung N. Kelompok pertama dibagi lagi menjadi 7 anak kelompok, dan kelompok kedua dibagi lagi menjadi 10 anak kelompok. Pembagian dan jumlah MS dapat dilihat pada Tabel 1. Table 1. Kelompok metabolit sekunder dan jumlahnya pada tanaman tingkat tinggi Jumlaha

Jenis metabolit sekunder Mengandung Nitrogen Alkaloid

21 000

Asam amino bukan protein

700

Amina

100

Glikosida sianogenik

60

Glucosinolat

100

Alkamida

150

Lektin, peptida, polipeptida

2000

Tanpa Nitrogen Monoterpen (C10)b

2500

Sesquiterpen C15)b

5000

Diterpen (C20)b

2500

Triterpen, steroid, saponin (C30,

5000

C27)b Tetraterpen (C40)b

500

Flavonoid, tannin

5000

Fenilpropanoid,

lignin,

2000

coumarin, lignan

a

Poliacetilen, asam lemak, lilin

1500

Poliketida

750

Karbohidrat, asam organik

200

Perkiraan jumlah dari struktur yang diketahui.

b

Total jumlah terpenoid melebihi 22000 saat ini. (Wink ,2010)

3

III.

Prosedur percobaan 3.1 alat dan bahan a. alat 

Erlenmeyer 250 mL



Gelas ukur 50 mL



Corong



Cawan porselin



Corong pisah



Tabung reaksi



Pipet tetes



Lempeng porselin

b. Bahan 

Bagian dari tumbuhan



Anhidrida asetat



Metanol



Etanol HCl pekat



Larutan H2SO4 2M



Amilalkohol



Kloroform



Larutan NaOH 1N



NH4OH



Larutan FeCl3 1%



H2SO4 pekat



Pereaksi Bouchardat



Larutan HCl 2N



Pereaksi Dragendorff



Serbuk Mg



Pereaksi Meyer

3.2 skema kerja 1. Pengumpulan bahan tumbuhan 50 g sampel tumbuhan Dikumpulkan Dicatat nama ilmiah dan nama lokal Hasil pengamatan

4

2. Penapisan Senyawa Metabolit Sekunder 10 g sampel bagian tumbuhan Dipotong-potong kecil 100 mL campuran metanol-air (4:1) Ditambahkan Diaduk Didiamkan selama 5 – 15 menit Disaring Diuapkan filtratnya H2SO4 2M Ditambahkan 5 – 15 mL CHCl3

Digunakan untuk ekstrasi dan lakukan sebanyak 3 kali Dilakukan identifikasi untuk senyawa golongan terpenoid/steroid, flavonoid, kuinon, tanin dan saponin Hasil pengamatan

lapisan air-asam dibasakan sampai pH 10 CHCl3-Metanol (3:1)

5

digunakan untuk mengekstraksi sebanyak 2 kali diidentifikasi untuk senyawa golongan alkaloid Hasil pengamatan

3. Identifikasi senyawa golongan terpenoid/steroid dengan uji Lieberman-Burchard 1 – 2 mL ekstrak CHCl3 Dimasukkan pada tabung reaksi 2 tetes anhidrida asetat Ditambahkan Diaduk 1 – 2 tetes H2SO4 pekat Ditambahkan Diamati amati warna yang terbentuk Dicatat warna yang terbentuk pada saat diteteskan Dicatat warna setelah dibiarkan beberapa saat Hasil pengamatan 4. Identifikasi senyawa golongan saponin 10 mL ekstrak CHCl3 Dimasukkan dalam tabung reaksi dikocok vertikal selama 10 detik

6

1 tetes larutan HCl 2N ditambahkan Hasil pengamatan

5. Identifikasi senyawa golongan flavonoid 5 mL ekstrak CHCl3 Dimasukkan ke tabung reaksi serbuk Mg, 2 mL larutan etanolHCl (1:1) dan 5 mL amil alkohol Ditambahkan Dikocok dan amati perubahan warnanya. Hasil pengamatan

6. Identifikasi senyawa golongan kiunon 5 mL ekstrak CHCl3 Dimasukkan ke tabung reaksi 2 mL larutan NaOH 1N Ditambahkn Diaduk dan amati warna yang terbentuk Hasil pengamatan

7

7. Identifikasi senyawa golongan tannin ekstrak CHCl3 Dimasukkan pada lempeng porselin larutan FeCl3 1% Diteteskan Hasil pengamatan nn 8. Identifikasi senyawa golongan alkaloid Uji dengan pereaksi Bouchardat ekstrak CHCl3Metanol Dimasukkan pada lempeng porselin pereaksi Bouchardat ditambahkan Hasil pengamatan

Uji dengan pereaksi Meyer 1 mL ekstrak CHCl3-Metanol Dimasukan pada lempeng porselin 1 – 2 tetes pereaksi Meyer Ditambahkan Hasil pengamatan

8

Uji dengan pereaksi Dragendorff 1 mL ekstrak CHCl3-Metanol Dimasukkan pada lempeng porselin 1 – 2 tetes pereaksi Dragendorff ditambahkan Hasil pengamatan

9

IV.

Data pengamatan dan perhitungan 4.1 data pengamatan No Hasil 1

Pengumpulan bahan tumbuhan  50 gr daun sirih merah (Piper Crocatum) kering

2

Penapisan senyawa matabolit sekunder  Volume filtrate hasil maserasi yang diperoleh 87 ml  Volume ektsrak pada lapisan atas yang diperoleh 78,5 ml  Volume ektsrak pada lapisan bawah yang diperoleh 25 ml

3

Identifikassi senyawa golongan terpenoid / steroid dengan uji Lieberman-burchad  Hasil uji tidak positif  Perubahan warna larutan menjadi lebih pekat daripada warna awal

4

Identifikasi senyawa golongan saponin  Saat tetesan pertama HCl timbul busa namun langsung hilang  Diperkirakan kandungan saponin yang ada hanya sedikit

5

Identifikasi senyawa golongan flavonoid  Warna larutan hija kekuningan  Mengalami perubahan suhu karena Mg bereaksi  Diperkirakan kandungan flavonoid yang ada hanya sedikit

6

Identifikasi senyawa golongan kiunon  hasilnya negatif  Warna larutan menjadi kekuningan  Terdapat endapan

7

Identifikasi senyawa golongan tannin  hasilnya positif

10

 Warna yang terbentuk menjadi hijau kehitaman 8

Identifikasi senyawa golongan alkaloid Uji dengan pereaksi meyer  Uji positif  Terdapat endapan kuning muda Uji dengan pereaksi dragendorff  hasilnya positif  terdapat lapisan jingga

4.2 pembahasan Metabolit sekunder adalah senyawa metabolit yang tidak esensial bagi pertumbuhan organisme dan ditemukan dalam bentuk yang unik atau berbeda-beda antara spesies yang satu dan lainnya. Setiap organisme biasanya menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang berbeda-beda, bahkan mungkin satu jenis senyawa metabolit sekunder hanya ditemukan pada satu spesies dalam suatu kingdom. Senyawa ini juga tidak selalu dihasilkan, tetapi hanya pada saat dibutuhkan saja atau pada fase-fase tertentu. Fungsi metabolit sekunder adalah untuk mempertahankan diri dari kondisi lingkungan yang kurang menguntungkan, misalnya untuk mengatasi hama dan penyakit, menarik polinator, dan sebagai molekul sinyal. Singkatnya, metabolit sekunder digunakan organisme untuk berinteraksi dengan lingkungannya. Senyawa metabolic sekunder dapat berupa alkaloid, flavonoid, terpenoid, steroid dan tanin, Pada praktikan kali ini,percobaan yang praktikan lakukan sebagai berikut: 1. pengumpulan bahan tumbuhan pengumpilan

bahan

tumbuhan

dilakukan

sehari

sebelum

melakukan percobaan,setelah di peroleh,daun sirih merah tersebut dipotong kecil-kecil kemudian di keringkan.daun yang dipilih adalah daun sirih merah.nama latin daun sirih merah yaitu Piper Crocatum.

11

Alasan praktikan memilih daun tersebut sebagai sampel yang akan digunakan karena Dalam daun sirih merah terdapat senyawa fito-kimia yang mengandung alkaloid, tannin, saponin dan flavonoid yang berhubungan dalam percobaan ini.

Gambar 4.2.1:Daun Sirih Merah 2. penapisan senyawa metabolit sekunder Untuk dapat menguji adanya kandungan metabolit sekundernya, perlu pertama-tama untuk mengisolasi/ mengekstrak kandungan metabolit

tersebut.

Pada

pengerjaannya

dilakukan

dengan

menggunakan metanol, dimana metanol ini dapat melarutkan secara umum kandungan metabolit sekunder dengan berbagai kepolarannya. pada penapisan senyawa metabolit sekunder ini digunakan matanol air 4:1 untuk tahap maserasi.kemudian filtrate nya disaring.filtrat yang diperoleh berwarna hijau serta volume yang diperoleh 87 ml. lalu filtrate tersebut diuapkan .selanjutnya yaitu diasamkan.Filtrat tersebut diekstraksi sebanyak tiga kali sehingga di peroleh ekstrak CHCl3 (ekstrak polar pertengahan) dan lapisan air-asam.volume ekstrak CHCl3 yang diperoleh yaitu 78,5 ml. Pada preparasinya ekstrak tersebut difraksinasi lagi ke kelompok polar dengan pelarut air dan kelompok non polar untuk metabolit yang terlarut pada fraksi kloroform. Setelah itu baru dilakukan uji identifikasi dari masing-

12

masing fraksi. Pada fraksi air dapat diuji identifikasi metabolit sekunder yang bersifat polar yaitu flavonoid selanjutnya terhadap ekstrak CHCl3 yang diperoleh dilakukan untuk

identifikasi

senyawa

terpenoid/steroid,flavonoid,kuinon,tannin

dan

golongan saponin.sedangkan

pada lapisan air-asam dubasakan sampai pH 10 dan selanjutnya diekstraksi 2 kali sehingga diperoleh ekstrak CHCl3-metanol (ekstrak basa) dan lapisan air-basa. volume ekstrak CHCl3-metanol (ekstrak basa) yang diperoleh yaitu 25 ml.pada ekstrak CHCl3-metanol (ekstrak basa) dilakukan identifikasi untuk senyawa golongan alkaloid 3. Identifikasi senyawa golongan terpenoid/steroid dengan uji Lieberman-burchard 2 ml ekstrak CHCl3 di beri 2 tetes anhidrida asetat dan 2 tetes H2SO4 menghasilkan uji yang negative dan mengalami perubahan warna menjadi lebih pekat.berarti daun sirih merah tidak mengandung terpenoid.karena berdasarkan reaksi Liebermann-Buchard yang menyatakan bila suatu steroid direaksikan dengan asam asetat anhidrat dan setetes asam sulfat pekat akan menghasilkan warna hijau atau biru Reaksi yang terjadi antara steroid dengan asam asetat anhidrat adalah reaksi asetilasi gugus –OH pada steroid. Menurut literatur yang diperoleh,terpenoida merupakan komponenkomponen tumbuhan yang mempunyai bau dan dapat diisolasi dari bahan

nabati

dengan

penyulingan

disebut

sebagai

minyak

atsiri.Minyak atsiri yang berasal dari bunga pada awalnya dikenal dari penentuan struktur secara sederhana, yaitu dengan perbandingan aton hidrogen dan atom karbon dari suatu senyawa terpenoid yaitu 8 : 5 dan dengan perbandingan tersebut dapat dikatakan bahwa senyawa tersebut adalah golongan terpenoid. Sebagian besar terpenoid mempunyai kerangka karbon yang dibangun oleh dua atau lebih unit C-5 yang

13

disebut unit isopren. Unit C-5 ini dinamakan demikian karena kerangka karbonnya sama seperti senyawa isoprene. Karena hasil uji negative,berarti daun sirih merah juga tidak menagndung steroid.menurut literature, steroid yang terdapat dalam jaringan tumbuhan berasal dari triterpenoid sikloartenol setelah triterpenoid ini mengalami serentetan perubahan tertentu. tahap- tahap awal dari biosintesa steroid adalah sama bagi semua steroid alam yaitu pengubahan asam asetat melalui asam mevalonat dan skualen (suatu triterpenoid) menjadi lanosterol dan sikloartenol. Beberapa contoh terpenoid

Gambar 4.2.3:contoh terpenoid 4. Identifikasi senyawa golongan saponin 10 ml CHCl3 dikocok selama 10 detik dan ditambahkan 1 tetes HCl 2N menghasilkan busa pada penetesan pertama tetapi busa tersebut langsung menghilang.menurut literature,daun sirih merah mengandung saponin. Pada uji saponin yang menggunakan filtrat daun sirih merah setelah dilakukan pengocokan kuat pada filtrat akan terbentuk busa, busa ini terjadi karena rantai gula yang terkandung dalam filtrat pecah. Untuk membuktikan busa yang terbentuk merupakan hasil dari adanya rantai gula yang pecah dapat ditambahkan HCl encer, jika saponin maka busa akan tetap stabil. Sifat-sifat Saponin adalah: 1. Mempunyai rasa pahit 2. Dalam larutan air membentuk busa yang stabil 3. Menghemolisa eritrosit 4. Merupakan racun kuat untuk ikan dan amfibi

14

5. Membentuk persenyawaan dengan kolesterol danhidroksisteroid lainnya 6. Sulit untuk dimurnikan dan diidentifikasi 7. Berat molekul relatif tinggi, dan analisis hanya menghasilkan formula empiris yang mendekati.

Gambar 4.2.4:Struktur saponin

5. identifikasi senyawa golongan flavonoid 5 ml ekstrak CHCl3 ditambah setengah sendok Mg dan 2 ml larutan etanol-HCl (1:1) dan 5 ml amil alcohol menghasilkan warna larutan yang berwarna hijau kekuningan serta terjadi perubahan suhu menjadi hangat karena Mg bereaksi. Menurut literature,daun sirih merah mengandung flavonoid. Flavonoid adalah suatu kelompok yang termasuk ke dalam senyawa fenol yang terbanyak dialam, senyawa-senyawa flavonoid ini bertanggung jawab terhadap zat warna ungu, merah, biru dan sebagian zat warna kuning dalam tumbuhan. Berdasarkan strukturnya senyawa flavonoid merupakan turunan senyawa induk “flavon” yakni nama sejenis flavonoid yang terbesar jumlahnya dan lazim ditemukan, yang terdapat berupa tepung putih pada tumbuhan primula. Sebagian

15

besar flavonoid yang terdapat pada tumbuhan terikat pada molekul gula sebagai glikosida, dan dalam bentuk campuran, jarang sekali dijumpai berupa senyawa tunggal. Disamping itu sering ditemukan campuran yang terdiri dari flavonoid yang berbeda kelas.

Gambar 4.2.5: Struktur flavonoid Sifat Fisika dan Kimia Senyawa Flavonoid.Flavonoid merupakan senyawa polifenol sehingga bersifat kimia senyawa fenol yaitu agak asam dan dapat larut dalam basa, dan karena merupakan senyawa polihidroksi(gugus hidroksil) maka juga bersifat polar sehingga dapat larut dalan pelarut polar seperti metanol, etanol, aseton, air, butanol, dimetil sulfoksida, dimetil formamida. Flavonoid dalam tumbuhan mempunyai empat fungsi : a) Sebagai pigmen warna b) Fungsi patologi dan sitology c) Aktivitas farmakologi 6. identifikasi senyawa golongan kiunon 5 ml ekstrak CHCl3 ditambahkan degan NaOH 1 N menghasilkan uji yang negative.warna larutannya berwarna kekuningan serta terdapat endapan. Menurut literature,daun sirih merah tidak mengandung senyawa kuinon. Kuinon adalah senyawa berwarna yang mencapai kromospor dasar, seperti kromospor pada benzo kuinon yang terdiri atas dua gugus karbonil yang berkonjugasi dengan dua ikatan rangkap karbon.

16

Untuk mengidentifikasi kuinon, dapat dipilih empat kelompok, yaitu benzokuinon, naftokuinon, antrakuinon, kuinon isoprenoid. Tiga kelompok pertama biasanya terhidrolisasi dan bersifat senyawa fenol. Dengan demikian, diperlukan hidrolisis asam untuk melepaskan kuinon bebasnya

Gambar 4.2.6: struktur kiunon

7. identifikasi senyawa golongan tannin ekstrak CHCl3 ditambahkan FeCl3 1 % menghasilkan uji yang positif terhadap daun sirih merah karena memberikan warna hijau kehitaman.Hal ini terjadi karena adanya reaksi reduksi. Tanin merupakan golongan senyawa polifenol, polifenol mampu mereduksi besi (III) menjadi besi (II) (Budini, 1980). Hal ini juga merupakan cara klasik untuk mendeteksi senyawa fenol, yaitu dengan menambahkan larutan besi(III) klorida 1% dalam air atau etanol pada larutan cuplikan menimbulkan warna hijau, merah, ungu, biru atau hitam

Gambar 4.2.7: struktur tannin

17

8. identifiasi senyawa golongan alkaloid Alkaloid adalah suatu golongan senyawa organik yang terbanyak ditemukan dialam. Hampir seluruh senyawa alkaloida berasal dari tumbuh-tumbuhan dan tersebar luas dalam berbagai jenis tumbuhan. Semua alkaloida mengandung paling sedikit satu atom nitrogen yang biasanya bersifat basa dan dalam sebagian besar atom nitrogen ini merupakan bagian dari cincin heterosiklik. Alkaloida dapat ditemukan dalam berbagai bagian tumbuhan seperti biji, daun, ranting dan kulit batang. Alakloida umumnya ditemukan dalam kadar...