[PION] Enzymy PDF

Preview

Summary

Download [PION] Enzymy PDF

Description

SEMINARIUM 3-4

1. KATALIZA, ENERGIA AKTYWACJI – definicja pojęć. 



 

KATALIZA - jest to zjawisko polegające na zwiększeniu szybkości reakcji chemicznej i/lub skierowaniu reakcji na jedną z kilku możliwych termodynamicznie dróg prowadzących do różnych produktów, w obecności niewielkich ilości substancji zwanych katalizatorami. Substancje te tworząc nietrwałe połączenia przejściowe, nie są jednakże zużywane w reakcji i nie występują w jej równaniu stechiometrycznym. Katalizator nie zmienia przy tym położenia równowagi chemicznej, wpływa jedynie na szybkość dochodzenia układu do tego stanu. Katalizator definiuje się więc jako substancję, która zwiększa szybkość z jaką reakcja chemiczna osiąga stan równowagi, sama się jednak nie zużywa i której symbol nie występuje w równaniu stechiometrycznym. ENERGIA AKTYWACJI – jest to najmniejsza ilość energii, którą trzeba dostarczyć 1 molowi substancji, aby 100% cząsteczek uległo aktywacji. Stan przejściowy – największa energia swobodna ze wszystkich związków w danej reakcji.



2. ENZYMY A KATALIZATORY NIEORGANICZNE – podobieństwa i różnice.    





Enzymy to katalizatory, które zwiększają szybkość przemiany substratów w produkty, a budowa ich po reakcji nie ulega zmianie. Działalność enzymów pozwala na obniżenie energii aktywacji same Ne podlegają przemianie (budowa i właściwości są takie same przed i po reakcji) Enzymy wykazują zdolność przyspieszenia reakcji chemicznej tylko takiej, która jest termodynamicznie możliwa ( tzn. energia substratów musi być większa od energii produktów) – w ich obecności reakcja może zachodzić 106 – 1015 razy szybciej STRUKTURA: 1. białka 2. (RNA) – rybozymy 3. specyficzne względem substratów i produktów 4. aktywność podlega regulacji DZIAŁANIE enzymów polega na: 1. obniżaniu energii aktywacji 2. stabilizacji stanu przejściowego 3. nie zmienia energii substratów i produktów np. katalazy w reakcji: 2 H2O2 ------ H2O + O2 obniżają energię aktywacji z 75 do 8,4 kJ/mol, prędkość reakcji zwiększa 300 mld razy

 ENZYMY 1. to białka (znane są reakcje katalizowane przez RNA)

KATALIZATORY NIEORGANICZNE związki nieorganiczne

1

2. często do reakcji wymagają dodatkowej cząsteczki zwanej koenzymem 3. charakteryzują się dużą specyficznością do substratu 4. obniżają energię aktywacji

obniżają energię aktywacji

5.

3. HOLOENZYM, APOENZYM, KOENZYM, GRUPA PROSTETYCZNA – definicje pojęć, funkcje w 

katalazie KOENZYM – drobnocząsteczkowe związki organiczne lub jony nieorganiczne, których obecność w centrum aktywnym jest niezbędna do katalitycznego działania tego enzymu. a) Określa rodzaj katalizowanej reakcji. Może brać udział w różnych reakcjach chemicznych zależnie od białka z którym jest związany. b) Koenzymy są składnikami łatwo odszczepialnymi, tworzącymi luźne połączenia z białkiem enzymatycznym



APOENZYM – to część białkowa enzymu. Decyduje o specyficzności substratowej enzymu czyli jaki substrat ulega przemianie w produkt oraz o kierunku reakcji (ten sam substrat może dawać różne produkty)



HOLOENZYM = APOENZYM + KOENZYM



Koenzym i grupa prostetyczna enzymu decydują najczęściej o rodzaju katalizowanej przez ten enzym reakcji



GRUPA PROSTETYCZNA – jest to niebiałkowy składnik enzymu związany z nim stosunkowo trwale i tworzący z białkiem pozornie niedysocjujące połączenia. Ich oddzielenie i ponowne połączenie z białkiem nie zawsze prowadzi do odtworzenia katalitycznie czynnego enzymu. Przykłady: - pochodne flawinowe – FAD, FMN dehydrogenaza bursztynianowa, oksydaza ksantynowa, oksydaza aminokwasowi, dehydrogenaza acyloCoA, dehydrogenaza aldehydowa, dehydrogenaza kwasu liponowego. - żelazoporfiryny oksydaza ksantynowa, katalaza, peroksydaza



Różnice pomiędzy grupą prostetyczną a koenzymem: 1. siły wiązania z apoenzymem Przykłady grup prostetycznych: 2

- pochodne flawinowe – FAD i FMN (dehydrogenaza bursztynianowa, oksydaza: ksantynowa, aminokwasowa, dehydrogenaza: acyloCoA, aldehydowa, kwasu limonowego - żelazoporfiryny – oksydaza ksantynowa, katalaza, peroksydaza Koenzymy są składnikami łatwo odszczepialnymi. Tworzą raczej luźne połączenia z białkiem enzymatycznym. Po oddzieleniu koenzymu od apoenzymu stanowią one jednostki nieczynne katalitycznie, które po ponownym połączeniu z białkiem enzymatycznym tworzą aktywny holoenzym. Przykłady koenzymów: - NAD+ i NADP+ - które występują głównie w dehydrogenazach NAD+ w mleeczanowej, alkoholowej i jabłczanowej NADP+ - d. glukozo-6-fosforanowej 2. sposobem regeneracji w reakcji enzymatycznej

4. ROLA METALI W KATALAZIE ENZYMATYCZNEJ, metaloenzymy a enzymy aktywowane przez  

metale METALOENZYMY – zawierają atom metalu ENZYMY AKTYWOWANE PRZEZ METALE -

5. IZOENZYMY – definicja, metody rozdziału, znaczenie diagnostyczne     

Są to różne formy enzymów katalizujących tą samą reakcję. Są to cząsteczki kodowane przez różne geny – np.: CPK w mm szkieletowych, sercu i mózgu Izoenzymy – są to genetycznie uwarunkowane odmiany enzymu, występujące w organizmach tego samego gatunku, katalizujące tą samą reakcję, a różniące się strukturą molekularną i niektórymi parametrami kinetyki enzymatycznej Zazwyczaj różnią się składem podjednostkowym lub sekwencją aminokwasowi POCHODZENIE IZOENZYMÓW: 1. izoenzymy są wytworzone przez różne geny zajmujące różne loci – MULTI LOCI a) geny dla danych izoenzymów mogą występować na tym samym chromosomie np.: amylaza (enzym występujący w soku trzustkowym oraz enzym występujący w ślinie jest kodowany przez geny występujący na tym samym chromosomie) b) geny izoenzymów są na różnych chromosomach np. dehydrogenaza jabłczanowa, enzym cyklu Krebsa 2. w obrębie danego allelu występuje duży polimorfizm – czyli loci jest jedno, ale są różne postacie alleliczne genu kodującego dany enzym. Takie enzymy nazywamy ALLELOZYMAMI lub alleloenzymami np.: dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa, kluczowy enzym cyklu pentozowego. Możemy wśród formallelicznych izoenzymatycznych tego enzymu wyselekcjonować, takie formy, których aktywność będzie obniżona – enzym nie będzie pełnił swojej funkcji, a klinicznie będzie się to manifestowało hemolizą czyli rozpadem krwinki czerwonej

3

 





3. Jeśli enzym ma charakter oligomeryczny – każda z podjednostek jest kodowana przez inny gen. W efekcie może być różna asocjacja podjednostek – izoenzymy HYBRYDOWE Izoenzymy są bardziej charakterystyczne dla danej tkanki, niż całkowita aktywność enzymów Izoenzymy – zmiana profilu a) zależna od rozwoju np. fosfataza alkaliczna – u dzieci do około 12 roku życia, głównym izoenzymem jest izoenzym kostny. Powyżej 12 roku życia głównym izoenzymem jest izoenzym wątrobowo-żółciowy b) zależna od choroby np. fosfataza alkaliczna Niespecyficzne tkankowo fosfatazy alkaliczne (pochodzenia kostnego, wątrobowego, nerkowego) są kodowane na chromosomie 1. istnieje drugi rodzaj fosfatazy alkalicznej, który jest kodowany na chromosomie 2 – w warunkach fizjologicznych pojawia się ona wyłącznie w ciąży. W niektórych chorobach nowotworowych pojawiają się izoenzymy, które przypominają izoenzym łożyskowy. Ich główna cecha fizykochemiczna to odporność na temperaturę. Izoenzym Nagao, izoenzym Regan, izoenzym Kasahara. Pojawienie się tych izoenzymów u osoby, która nie jest w ciąży np. u mężczyzny świadczy o przestrojeniu nowotworowym komórki ZRÓŻNICOWANIE WŁAŚCIWOŚCI IZOENZYMÓW 1. zmienia się ruchliwość elektroforetyczna – przy czym nie zawsze jest to uchwytne rutynowymi metodami elektroforetycznymi (często wiąże się to tylko ze zmianą ładunku). 2. zmienia się rozpuszczalność 3. zmiana odporności na inaktywacje fizykochemiczna (najprostszy sposób inaktywacja cieplna, ale jest to technika dość mało specyficzna) 4. zmiana wrażliwości na inhibitory (np. L-winian stosowany przy różnicowaniu izoenzymów fosfatazy kwaśnej) 5. zmienia się aktywność molekularna czyli liczba cząsteczek substratu przekształconych w produkty, w czasie 1 minuty przez 1 cząsteczkę enzymu, w optymalnych warunkach 6. zmienia się powinowactwo do pewnych substratów - stała Michaelisa 7. zmienia się zdolność do katalizy reakcji z udziałem analogów substratów 8. zmienia się antygenowość Antygenowość zmienia się najczęściej w dwóch przypadkach: - są to enzymy pochodzące z różnych loci - lub enzymy zbudowane z różnych podjednostek Czyli do oceny tych izoenzymów możemy używać metod immunologicznych METODY ROZDZIAŁU IZOENZYMÓW: I. Elektroforeza a) elektroforeza wysokonapięciowa b) elektroogniskowanie w gradiencie pH II. Chromatografia a) najczęściej chromatografia powinowactwa b) HPLC – chromatografia wysokociśnieniowa III. Inaktywacja chemiczna – czyli stosowanie swoistych inhibitorów IV. Inaktywacja fizyczna – najczęściej cieplna

4

V.



Właściwości katalityczne a) używanie analogów substratów, które są przemieniane tylko przez jedną formę izoenzymu b) używanie swoistych inhibitorów, które hamują konkretny izoenzym VI. metody immunologiczne Enzymy heterogenne nie będące izoenzymami - enzymy zmodyfikowane posttranslacyjnie 1. acylacja – enzym jest inny, ma inną ruchliwość elektoferetyczną 2. przyłączenie reszty cukrowej – glikacja – ma duże znaczenie, występuje głównie w cukrzycy. W wyniku takiej glikacji szereg enzymów, w tym enzymy antyoksydacyjne jak: dysmutaza ponadtlenkowa, peroksydaza glutationowa tracą swą aktywność. Mają one inną ruchomość elektroforetyczną, inne powinowactwo do substratu, ale nie są izoenzymami (jest to nieprawidłowo zmutowane białko) 3. Przemiana proenzymu w enzym – proenzym i enzym jest to ten sam enzym, ale raz w formie nieaktywnej, a raz w aktywnej 4. D-amidacja 5. Powstawanie mostka disulfitowego – np. t-PA w formie łańcuchowej i dwułańcuchowej – jest to to samo białko enzymatyczne 6. zmiany w fosforylacji – np. aktywna i nieaktywna fosforylaza (enzym biorący udział w glikogenolizie i glikogenogenezie). Są to różne formy enzymu, ale nie izoenzymy 7. Asocjacja z innymi białkami – szczególnie lubią asocjować z enzymami immunoglobuliny np. amylaza trzustkowa może połączyć się z Ig i wtedy jej pewne właściwości ulegają zmianie 8. agregacja molekuł – powstają formy dimeryczne (oligomeryczne)



6. CENTRA AKTYWNE ENZYMU     

centrum aktywne - to miejsce, które wiąże substraty i odpowiada za przebieg reakcji katalizowanej przez enzym Miejsce aktywne zajmuje stosunkowo małą część całkowitej objętości cząsteczki enzymu Miejsce aktywne jest układem przestrzennym złożonym z grup chemicznych reszt aminokwasowych, zajmujących różne liniowo odległe pozycje. Aminokwasy biorące bezpośredni udział w katalizie znajdują się w odległości 0,2 nm od substratu W tworzeniu miejsca aktywnego uczestniczą przede reszty aminokwasowi, które w łańcuchach bocznych mają grupy mogące być donorami lub akceptorami protonów Np. grupy β - karboksylowe asparaginianu grupy γ – karboksylowe glutaminianu 5





grupy ε – aminowe lizyny atomy azotu zawarte w pierścieniu imidazolowym histydyny grupy –OH seryny, treoniny i tyrozyny grupy –SH cysteiny TEORIE WIĄZANIA SUBSTRATU PRZEZ ENZYM: I. Teoria E. Fischera – zakładała, że substrat pasuje do centrum aktywnego enzymu jak klucz do zamka II. Teoria D. E. Koshland – aktualnie dominująca – miejsce aktywne enzymu wytwarza się w chwili kontaktu enzymu z substratem Centrum aktywne = miejsce aktywne . W jego obszarze wyróżnia się: 1. miejsce wiązania substratu ( miejsce określające swoistość enzymu) 2. miejsce katalityczne, gdzie zachodzi reakcja 3. w przypadku enzymów allosterycznych – miejsce wiążące efektor czyli centrum allosteryczne

Aminokwasy wchodzące w skład centrum aktywnego - z uwagi na funkcję, jaką pełnią – dzieli się na cztery kategorie: 1. aminokwas lub a m i n o k w a s y b e z p o ś r e d n i o d z i a ł a j ą c e ; w enzymach złożonych ich rolę pełnią koenzymy lub grupy prostetyczne, 2. a m i n o k w a s y w s p o m a g a j ą c e , 3. aminokwasy kontaktowe , zwane również w i ą ż ą c y m i , 4. aminokwasy pomocnicze . Aminokwasy pomocni c ze nie biorą bezpośredniego udziału w katalizie, lecz niezbędne są do utrzymanie właściwej konformacji przestrzennej pozostałych aminokwasów centrum aktywnego (można je traktować, jako czynniki strukturotwórcze centrum aktywnego). Aminokwasy kont aktowe (w i ą ż ą c e ) odpowiedzialne są za rozpoznanie substratu i „wciągniecie” go do kieszonki centrum aktywnego. Z reguły są zlokalizowane na obrzeżach kieszonki. Odpowiedzialne są za specyficzność substratową enzymów

7. CENTRUM KATALITYCZNE – struktura i funkcja *

8. MODELE WIĄZANIA SUBSTRATU PRZEZ ENZYM *

9. SWOISTOŚĆ ENZYMU WZGLĘDEM KATALIZOWANEJ REAKCJI I WZGLĘDEM SUBSTRATU *

10. MECHANIZM KATALAZY ENZYMATYCZNEJ *

6

11. STRUKTURA MOLEKULARNA ENZYMÓW – enzymy mono- i oligomeryczne, przykłady ENZYMY MONOMERYCZNE – są to enzymy nie mające budowy podjednostkowej. Wyróżniamy wśród nich: a) enzymy o budowie pojedynczego łańcucha polipeptydowego np. występujący w ślinie lizozym oraz elastaza, trypsyna, heksokinaza b) enzymy posiadające więcej niż jeden łańcuch polipeptydowy np. chymotrypsyna  ENZYMY OLIGOMERYCZNE – czyli enzymy zbudowane z podjednostek, tzn. takie, w których jeden fragment cząsteczki z drugim jest połączony wiązaniami niekowalencyjnymi. 1. Typy wiązań niekowalencyjnych występujące w cząsteczce enzymów oligomerycznych: - najważniejsze znaczenie – oddziaływania hydrofobowe - wiązania jonowe - wiązania wodorowe 2. Pod względem budowy podjednostkowej można je podzielić na: a) homooligomery b) heterooligomery Podział ten zależny jest od tego czy wszystkie podjednostki maja taką samą budowę, czy różną. 3. Z budowy podjednostkowej enzymu wynikają dwa podstawowe fakty: I. Poprzez dysocjację podjednostek, czyli ich rozerwanie enzym może nie stracić zupełnie swojej aktywności, ale tor tej aktywności może się całkowicie zmienić. Np. dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego (jeden z enzymów glikolizy) w stanie natywnym występuje pod postacią tetrameru i wykazuje wtedy 2 aktywności: - dehydrogenazy - esterazy (hydrolaza rozrywająca wiązania estrowe) Jeśli doprowadzimy ją do dysocjacji czyli powstanie enzym w formie dimerowej, to traci on aktywność dehydrogenazy, ale pozostaje mu jeszcze aktywność esterazy. II. Podjednostki enzymu oligomerycznego wykazują zjawisko kooperacji między sobą co nosi nazwę allosterii. 4.  

12.  



KOMPLEKSY WIELOENZYMOWE –

budowa, stopnie organizacji, znaczenie, przykłady Kompleksy wieloenzymowe – ME = MultiEnzyme Complex – jest to kompleks kilku enzymów, które katalizują reakcje zazwyczaj następujące po sobie. Łączą się one w wyżej zorganizowane struktury. Celem tych połączeń jest doprowadzenie do sytuacji termodynamicznej korzystnej czyli takiej, w której transfer związków pośrednich następował od jednego enzymu do drugiego bez straty energii. Przykłady:

7



1. kompleks dehydrogenazy pirogronianowej – katalizuje przemianę kwasu pirogrononowego do acetyloCo-A – czyli proces dekarboksylacji oksydacyjnej pirogronianu 2. Najwyżej zorganizowanymi kompleksami wieloenzymowymi są kompleksy związane z błonami np. kompleks enzymatyczny łańcucha oddechowego związanego z wewnętrzną błoną mitochondrialną. Strata energii reakcji katalizowanych przez ten kompleks jest bardzo mała 3. kompleks bez tzw. pompy, w którym intermedianty (produkty pośrednie) oddysocjowują od kompleksu. Przykładem jest kompleks enzymatyczny pierwszych trzech reakcji, katalizujący biosyntezę pirymidyn – komplet CAD = MEpyr 1-3. C – oznacza syntetazę karbonoilofosforanową II = CPS II, A – ATC-aza czyli karbanoilotransferaza asparaginowa, trzecim enzymem jest dihydroprotaza. W kompleksie tym wykryto po raz pierwszy zjawisko umownie nazwane kabałowaniem czyli channelingiem (channeling). Zjawisko to ma polegać na przemieszczaniu się w sposób preferencyjny, bez strat energii intermediantu od jednego enzymu do drugiego. Czwarty enzym na szlaku biosyntezy pirymidyn jest enzymem wolnym 4. natomiast dwa kolejne enzymy szlaku biosyntezy pirymidyn tworzą znowu kompleks wieloenzymowy MEpyr 5-6. Kompleksy wieloenzymowe dotyczą różnych enzymów, które tworzą pewne ugrupowania katalizujące kolejne etapy szlaków metabolicznych

13.

ENDOENZYMY, EKTOENZYMY

*

14. KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNEJ – hiperboliczna i niehiperboliczna, sposoby 



jej przedstawiania, ocena powinowactwa enzym-substrat. Kinetyka reakcji enzymatycznych – określa szybkość i przebieg reakcji. Jest ważnym czynnikiem umożliwiającym zachowanie homeostazy przez dostosowanie szybkości reakcji enzymatycznych w organizmie do aktualnych warunków środowiska lub bodźców hormonalnych. Hiperboliczną kinetykę reakcji enzymatycznej obrazuje model Michaelisa – Menten. 1. Jego założeniem jest, że zawsze się tworzy kompleks E-S jako pośredni etap całego procesu 2. Równanie Michaelisa - Menten określa zależność szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia substratu. V V max

[S ] [S ]  K M

V – prędkość katalizowanej reakcji Vmax = prędkość max. jaką można byłoby teoretycznie osiągnąć w warunkach optymalnych [S] – stężenie substratu KM – stała Michaelisa, równa takiemu stężeniu substratu, przy którym prędkość reakcji jest równa połowie prędkości maksymalnej.

8

3. Jeżeli stężenie substratu jest znacznie mniejsze od tego, które jest wymagane do uzyskania połowy szybkości max., to szybkość reakcji zależy od stężenia substratu, bo Vmax i KM są wielkościami stałymi V Vmax

[S] > KM 5. Gdy [S] = KM to prędkość początkowa równa się połowie szybkości maksymalnej reakcji V = ½ Vmax [S] = KM 

15. CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA SZYBKOŚĆ REAKCJI ENZYMATYCZNEJ 1. 2. 3. 4. 5.

16.

Temperatura pH stężenie enzymu stężenie substratu aktywatory i inhibitory

REGULACJA ILOŚCI ENZYMU

*

17. 

REGULACJA AKTYWNOŚCI ENZYMU

Czynniki wpływające na aktywność enzymu 1. stężenie substratu 2. stężenie produktu 3. stężenie koenzymu 4. temperatura: a) szybkość reakcji rośnie wraz ze wzrostem temperatury ( do pewnego stopnia) – jest to związane ze zwiększeniem energii kinetycznej reagujących cząsteczek b) optimum temperatury 30 – 500 C c) ograniczona temperatura inaktywacji enzymu ( 700 C) d) współczynnik Q10 (określa o ile wzrośnie prędkość reakcji przy wzroście temperatury o 100 C) Q10 e) termostabilność i termolabilność – identyfikacja izoenzymu f) enzymy bakterii termofilnych (do 1000 C) – polimeraza Taq 5. pH a) optimum pH – szeroki zakres b) większość optimum 5 – 8

9

6. potencjał red-ox a) potencjał poza optimum może wywołać inaktywację b) redukcja lub utlenienie wiązań disiarczkowych 7. stała dielektryczna – siła jonowa 8. inhibitory 9. aktywatory 

18. REGULACJA KATALITYCZNEJ SPRAWNOŚCI ENZYMU (wpływ na sprawność katalityczną 

enzymu), interkonwsersja enzymu. Aktywacja proenzymu, kompartmentalizacja enzymów w organellach komórkowych – mechanizmy, przykłady Czyli zmiana aktywności enzymu bez zmian jego ilości I. regulacja allosteryczna – regulacja aktywności enzymu poprzez wprowadzenie białka allosterycznego b) związki pod wpływem, których enzym zyskuje aktywność to kinazy allosteryczne dodatnie (aktywatory allosteryczne) c) związki, pod których wpływem traci aktywność to kinazy allosteryczne ujemne (inhibitory allosteryczne) II. aktywacja proenzymów (zymogenów); np. enzymy trawienne Niektóre enzymy, szczególnie proteazy są syntetyzowane pod postacią nieaktywnych proenzymów. Przejście zymogenu w aktywny enzym wymaga odłączenia fragmentu cząsteczki fragmentu cząsteczki, który hamuje powstawanie lub funkcjonowanie miejsca aktywnego. W niektórych przypadkach enzym powstały z zymogenu staje się jego aktywatorem proteolitycznym. Zjawisko aktywacji zymogenu przez...