6. Enzymy – wykazanie aktywności enzymów w materiale biologicznym, wpływ wybranych czynników fizykochemicznych na aktywność enzymów PDF

Preview

Summary

Kartkówka 6 – Enzymy – wykazanie aktywności enzymów w materiale biologicznym, wpływ wybranych czynników fizykochemicznych na aktywność enzymówBudowa enzymów Enzymy składają się z: Białka globularne, zbudowane z ponad 100 reszt aminokwasowychSą to biokatalizatory komórkiPod względem chemicznym sa to ...

Description

Kartkówka 6 – Enzymy – wykazanie aktywności enzymów w materiale biologicznym, wpływ wybranych czynników fizykochemicznych na aktywność enzymów Budowa enzymów Enzymy składają się z: Białka globularne, zbudowane z ponad 100 reszt aminokwasowych Są to biokatalizatory komórki Pod względem chemicznym sa to białka (przeciwciała, wykazujące katalityczną aktywnośćabzyny , rybozymy – czasteczki RNA również sa enzymami) Częsc enzymów będzie aktywna przyłączając np. atomy metali , jednak Wiele enzymów jest aktywnych tylko w obecności niebiałkowych cząsteczek – kofaktorów. W przypadku tych enzymów, ich białkową część określamy mianem apoenzymu, a tworzony aktywny kompleks (kofaktor +apoenzym) - holoenzymem. Posiadają część białkowa enzymu z centrum aktywne, oraz niebiałkową czyli kofaktory Czesc białkowa: Zawiera 2 centra aktywne, które zajmuja mała czesc całkowitej objętości czasteczki enzymu.

Centrum aktywne, jest to obszar w którym enzym wiaze substraty/grupe prostetyczna i dostarcza reszt aminokwasowych, znajduja się w zagłębieniach – miejscach hydrofobowych , niedostępnych dla wody (jeżeli nie bierze udziału w reakcji). Specyficzność wiazania z nim substratyu zalezy od precyzyjnego określonego ułożenia atomów (zazwyczaj polaczenia substratu z enzymem jest słabe)

Za wiązanie substratu w miejscu aktywnym, w zależności od chemicznego charakteru substratu i reszt aminokwasowych tworzących miejsce aktywne, odpowiedzialne mogą być: oddziaływania elektrostatyczne i hydrofobowe, wiązania wodorowe oraz siły van der Waalsa.

Aby substrat mogł polaczyc się z miejscem aktywnym musi mieć odpowiedni kształt. Dlatego enzymy nie sa strukturami sztywnymi, a ich kształt ulega modyfikacji na skutek związania substratu. Komplementarny kształt miejsca aktywnego, względem substratu pojawia się dopiero gdy substrat zacznie zbliżać się do miejsca aktywnego. wymuszajac jego zmiane konformacji.

Charakteryzuje Się dużą asymetrią (co tez decyduje o właściwościach stereoselektywnosci – do 1 miejsca aktywnego pasuje tylko 1konkretny substrat). Miejsce aktywne często jest tworzone przez reszty aminokwasowe oddalone od siebie w sekwencji aminokwasowej – dopiero przybranie przez białko odpowiednio przestrzennej,trzeciorzędowej struktury powoduje zbliżenie tych reszt do siebie i utworzenie miejsca aktywnego. Centra Wiążące: Buduja reszty aminokwasowe, które maja one za zadanie odpowiednio związać substrat,ukierunkować i nastepnie wszytsko stabilizować ( lacznie z produktami końcowymi i pośrednimi) 1. katalizujace: tworza ugrupowania ,które bezpośrednio biorą udział w reakcji chemicznej

Rozdzielenie obu centrów bywa trudne, ponieważ działa inaczej w róznych czesciach enzymu

Kofaktory – część nie białkowa enzymu -przyłączają się przejściowo do enzymy lub substratu -w przypadku gdy dolaczone sa jony metalu uzywane jest stwierdzenie ”enzymy aktywowane przez metal” aby odróżnić je od metaloenzymów gdzie jony metalu sluza jako grupy prostetyczne Koenzymy -dyfunduja tylko na czas trwania reakcji i uwalniane wraz z jej produktami -przenosza grupy funkcyjne - transportuja substraty do miejsca ich przeznaczenia -stabilizuja substraty niestabilne w środowisku wodnym - np.: NAD+,NADH,AMP,ADP,folian,dolichol

1. grupa prostetyczna (jony metali) - nigdy nie opuszczaja struktury enzymu, stanowią jej czesc integralna -najczesciej grupe prostetyczna stanowią jony metali i są to metaloenzymy (zawieraja silni przyłączone jony Fe,Co,Cu,Mg,Mn i Zn) - np.: FAD,FMN Wiele koenzymów,kofaktorów i grup prostetycznych to pochodne witaminy B Rola biologiczna enzymów -Enzymy sa biokatalizatorami -Przyspieszaja zachodzenie reakcji do 10^3 -Wyakzuja wyjatkowa efektywność katalityczna – katalizuja reakcje ze 100% wydajnością (bez produktów ubocznych)

-Wykazuja selektywność absolutna przez co rozpoznaja tylko 1 wiazanie jako swój substrat oraz stereo selektywne – rozpoznaja 1 wlasciwy sobie izomer (rozpoznanie L-aminokwasów, nastomiast D-aminokwasy nie sa rozpoznawane) -Dzieki właściwościom katalitycznym uczestnicza w rozpadzie składników pokarmu w celu dostarczenia energii i chemicznych jednostek budulcowych do wbudowania tych jednostek w białka,DNA,błony,komórki a także w celu umozliwienia funkcjonowania nerwów i kurczenia się miesni -Rybozymy (rybosomalne RNA a także czasteczki RNA majace aktywność endonukleaz i ligazy nukleotydowej ) -Zaburzenia w ilości bądź aktywności enzymow mogą świadczyć o chorobach np.: defektów genetycznych,niedoboru pozywniea,uszkodzen tkanek,zatruciu toksynami,infekcjach -Udogadniaja Zycie ludziom: **- proteazy i amylazy zwiększają zdolność detergentów do usuwania brudu i plam -zwiekszaja wartość odzywcza produktów spożywczych, proteaza renina wykorzystywana do produkcji serów, laktoza do usuwania laktozy z mleka -biosynteza zlozonych lekow/antybiotyków

Klasy enzymów Enzymy można podzielić zw względu na typ reakcji katalizowanej na 6 klas: Oksyreduktazy: katalizuja reakcje utleniania i redukcji -przenoszenie elektronów i protonów lub bezpośrednie włączanie tlenu do substratu 1. Transferazy:katalizują reakcje przenoszenia ugrupowań funkcyjnych (innych niż H+) z jednego związku na zupełnie inny 2. Hydrolazy: katalizuja rozklad reakcji chemicznych przy udziale wody (hydrolizują wiązania chemiczne i sa to na przykład proteazy/hydrolazy)

3. Liazy: katalizuja rozklad reakcji chemicznych bez udziału wody typ rozerwanego wiązania (C–C, C–O, C–N, C–S) 4. Izomerazy: katalizuja przekształcenia wewatrzcząsteczkowe izomeru do innego izomeru ALE tego samego związku prawie zawsze katalizują reakcje w obu kierunkach 5. Syntetazy (ligazy): Odpowiedzialne za tworzenie się nowych wiazan 

typ utworzonego wiązania (C–C, C–O, C–N, C–S)

- potrzebna jest do tego energia, która jest czerpana z rozkładu wysokoenergetycznych wiązań (z ATP,CTP,UTP,GTP lub innego) Model wiązania enzym-substrat Wyróżniamy dwa modele łączenia się enzymu z substratem: 1. model klucza i zamka – gdzie enzym, tzn. jego miejsce aktywne, musi być dopasowany swoim kształtem do substratu by móc przekształcić go w produkt. Teoria ta jednak ma już tylko znaczenie historyczne

2. model indukowanego dopasowania -mechanizm opierający się na dopasowaniu kształtu enzymu do substratu lub odpowiedniej grupy substratów i przekształceniu ich w produkty. Poza tym enzym może zniekształcić substrat wymuszając w nim konformację podobną do stanu przejściowego. Przykładem może być związanie glukozy z heksokinazą.

Kinetyka reakcji enzymatycznych (model Michaelis-Manten, równanie Lineweavera-Burka) Kinetyka jest to badanie szybkości przekształcenia substratu w produkt. Zadaniem kinetyki jest ustalenie charakteru reakcji i matematyczne ujęcie zależności pomiędzy szybkością reakcji a czasem jej trwania, co pozwala na podanie szybkości reakcji w dowolnym czasie i przy dowolnym stężeniu substratu. Model Michaelis-Manten Jest to najprostrzy model tłumaczący kintykę enzymów. Tłumaczy ona że maksymalną szybkość reakcji się przy wyższym stężeniu substratu, kiedy wszystkie cząsteczki enzymu tworzą kompleks enzym – substrat (wszystkie enzymy są zajęte). Całkowite wysycenie enzymu substratem powoduje, że dalsze zwiększanie stężenia substratu nie może już wpłynąć na zwiększenie szybkości reakcji: reakcja przebiega ze stałą, maksymalną szybkością. Zależność tę przedstawia równanie zawierające tzw. stałą Michaelisa,charakterystyczną dla danego enzymu. Stała Michaelisa Km to wielkość liczbowa, określająca stężenie substratu (w molach na litr roztworu), przy którym szybkość reakcji enzymatycznej jest równa połowie szybkości maksymalnej, osiąganej przy wysyceniu enzymu substratem i niezależnej już od dalszego wzrostu jego stężenia.

Równanie Lineweavera-Burka Równanie Lineweavera-Burka jest przekształceniem wzoru Michaelisa Menten. Przekształcenie to ma na celu uzyskanie równania o ogólnej postaci linii prostej y = ax + b gdzie a to Km/Vmax, a b to 1/Vmax, natomiast x to 1/S. Gdzie S to stężenie substratu

1 1 =( Km 1 x )+ Vmax S Vmax V

Wpływ pH i temperatury na aktywność enzymów Enzymy do swojego działania (katalizowania) potrzebuja odpowiedniego ph o raz temperatury

pH środowiska wpływa na: • strukturę i ładunek substratu • strukturę stanu pośredniego • strukturę produktu • strukturę centrum aktywnego optimum aktywności większości enzymów jest bardzo wąskie (7,2-7,4) zależnie od ich struktury i charakteru oddziaływań enzym-substrat co Umożliwia na przykład regulację aktywności enzymów działających w przewodzie pokarmowym (enzymy aktywne w silnie kwaśnym pH żołądka, jak pepsyna czy lipaza żołądkowa, są dezaktywowane w dwunastnicy, która zawdzięcza swoje alkaliczne środowisko sokowi trzustkowemu. Skrajne wartości pH mogą nawet doprowadzić do denaturacji enzymu

Temperatura 

Wpływ temperatury na szybkość reakcji enzymatycznych nie jest prostą zależnością, gdyż pozostaje w ścisłym związku z białkową naturą enzymów.



Szybkość reakcji chemicznych wzrasta wraz ze wzrostem temperatury, co jest następstwem podwyższenia energii kinetycznej reagujących ze sobą cząsteczek , jednakże tylko w takim jej zakresie, w którym enzym jest stabilny i zachowuje pełną aktywność . Wielkość tego wzrostu opisuje współczynnik temperaturowy Q10, określający jak zmienia się szybkość reakcji (v) przy wzroście temperatury o 10ºC



Szybkość reakcji enzymatycznych wzrasta przeciętnie dwukrotnie przy każdym wzroście temperatury o 10ºC w zakresie temperatur nie powodujących denaturacji danego enzymu.



Wraz ze wzrostem temperatury szybkość reakcji enzymatycznej początkowo wzrasta, osiąga wartość maksymalną, a następnie maleje, wskutek denaturacji enzymu powodującej jego dezaktywację (utrata właściwości katalitycznych).

Inhibicja (kompetycyjna i niekompetycyjna) a inaktywacja INHIBITORY - gr. czynników chemicznych specyficznych, które działają odwracalnie modyfikująco na określony fragment cząsteczki enzymu, co powoduje obniżenie szybkości reakcji. Zjawisko specyficznego hamowania jest określone jako inhibicja. INAKTYWATORY - gr, czynników, która doprowadza do nieodwracalnego ścięcia białka (denaturacji). Proces niespecyficznego hamowania i nieodwracalnego hamowania nazywamy Inaktywacja. INHIBICJA polega na tym, że określona substancja (inhibitor) może się łączyć z jednym ze składników uczestniczących w reakcji enzymatycznej lub w inny sposób blokować ich współdziałanie. Do elementów tych należą: enzym, substrat, koenzym. Zjawisko hamowania aktywności enzymów przez różnego rodzaju związki (inhibitory) to mechanizm kontrolny dla procesów fizjologicznych. 1. Inhibicja odwracalna: a. -Kompetycyjne – ze względu na podobieństwo do substratu bądź produktu, inhibitor będzie się wiązać dokładnie w miejscu aktywnym czyli tam gdzie substrat, co doprowadzi do „konkurencji”. Działanie inhibitora kompetycyjnego można zmienszyć jeżeli doda się większe stężenie substratu, ponieważ to jego stężenie będzie wtedy większe i to on wygra walkę z inhibitorem

a. -Inhibitory niekompetycyjny – łaczy się w miejscu innym niż centrum, co sprwaia ze zachodza zmiany w centrum które za sprawą działania inhibitora luźno wiążą substrat przez co dochodzi do hamowania działania substratu.

b. Akompetycyjne: Wiążą się odwracalnie tylko do kompleksu enzym-substrat, tworząc nieaktywny kompleks ESI. Związanie inhibitora obniża stężenie kompleksu ES, co pozornie zwiększa powinowactwo enzymu do substratu (przesunięcie równowagi reakcji). Jest to rodzaj inhibicji rzadko spotykanej w reakcjach jednosubstratowych. Inhibicja nieodwracalna Polega na nieodwracalnym blokowaniu aktywnego centrum enzymu przez związki nie podobne strukturalnie do substratu. Inhibitor wiąże się kowalencyjnie (nie zawsze w obrębie centrum aktywnego i nieodwracalnie) do łańcuchów białkowych enzymu lub tak silnie, że dysocjacja kompleksu Enzym-inhibitor jest bardzo powolna co prowadzi do trwałego unieczynnienia enzymu oraz powoduje chemiczna modyfikacje aminokwasów w enzymie. Zasady metod doświadczeń wykonywanych na ćwiczeniach Wprowadzenie (ślina)

Enzymatyczna hydroliza skorbi i glikogenu zachodzi w obecności alfa-amylaz występujących w ślinie, trzustce a także słodzie. Enzymy te są endoglikolizami, tzn. atakują wiązania alfa-1,4,glikozylowe, położone wewnątrz łańcucha cząsteczki. Jako pierwsze produkty hydrolizy powstają erytrodekstryny, a następnie dekstryny o niskiej masie cząsteczkowej. Produktem końcowym hydrolizy jest maltoza. Beta-amylazy roślinne są egzoglikozydami. Hydrolizują one wiązania odczepiając od końca łańcucha po dwie reszty glukozy w postaci maltozy, y-amylaza wątroby i jelit jest egzoglikozydazą odszczepiającą z glikogenu glikozę poprzez hydrolizę zarówno wiązań 1,4glikozylowych jak i 1,6-glikozydowych. Oznaczanie aktywności amylazy w moczu metodą Wholgemuta Amylaza katalizuje hydrolizę skrobi do produktów niedających niebieskiej barwy jodem. Betaamylaza rozkłada co drugie wiązanie glikozydowe, w wyniku czego tworzy się maltoza, natomiast alfa-amylaza atakuje wiązania glikozydowe leżące z dala od siebie, wytwarzając dekstryny, a następnie dicukry. Natężenie barwy kompleksu jodu ze skrobią jest proporcjonalne do ilości skrobi w roztworze. W miarę zatem rozkładu skrobi przez enzym, natężenie barwy zmniejsza się. Odczynniki – 0,1% kleik skorbiowy w NaCl, zbuforowany NaCl w pH 7,3, 0,02M I2 w KI, mocz. Oznaczanie aktywności amylazy w ślinie Aktywność amylazy mierzy się poprzez ocenę stopnia hydrolizy skorbi, która jest substratem dla enzymu. Mieszaninę reakcyjną poddaje się inkubacji, podczas której w odstępach czasowych sprawdza się ją pod kątem zawartości niezhydrolizowanej skrobi, wykonując próbę z jodem. Jod cząsteczkowy ma zdolność wnikania do śrubowato skręconych łańcuchów skrobi, gdzie tworzy szereg, wzdłuż którego mogą przemieszczać się elektrony. Tak powstały kompleks ma barwę od ciemnofioletowej do czerwono-fioletowej (z erytrodekstrynami). Doświadczenie prowadzi się aż do osiągnięcia tak zwanego punktu achromoweo, tj. czasu, po którym nie uzyskuje się fioletowego zabarwienia w próbie z jodem, ponieważ całą skrobia dodana do mieszaniny enzymatycznej ulega hydrolizie do produktów nie tworzących barwnych kompleksów. -1M Hcl, 1%NaCl, płyn lugola, 0,1% kleik skrobiowy, bufor fosforanowy o pH 6,6 i ślina Wykrywanie oksydazy ksantynowej w mleku Oksydaza ksantynowa należy do enzymów flawinowych. Przenosi wodory z substratu na tlen cząsteczkowy wytwarzając H2O2. Enzym ten odznacza się małą swoistością. Oprócz ksantyny może także utleniać niektóre puryny, pteryny i aldehydy do kwasów. Inhibitorem enzymu są cyjanki. W środowisku beztlenowym wodór z FADH2 może być przenoszony na sztuczny akceptor, np. błękit metylenowy, który przechodzi w bezbarwny związek, tzw. biel błękitu metylenowego. -Mleko świeże, mleko zagotowane, 0,02%błękit metylenowy, 0,5% aldehyd mrówkowy, parafina aq...