4. Białka – ilościowe oznaczanie białek w materiale biologicznym PDF

Preview

Summary

Zagadnienia na 4ą wejściówke o białkach...

Description

Kartkówka 4 – Białka – ilościowe oznaczanie białek w materiale biologicznym • Struktury I-, II-, III- i IV- rzędowe białek, wiązania stabilizujące te struktury Białka posiadają budowę przestrzenną, w której możemy wyróżnić kilka poziomów organizacji, omówionych poniżej. Struktura I-rzędowa- Jest to najniższy i podstawowy poziom organizacji białka, jest to sekwencja aminokwasów związanych wiązaniami peptydowymi. To na tym poziomie sekwencja aminokwasowa jest kodowana genetycznie i determinuje struktury wyższego rzędu, to w nich jest wszystko „zapisane”. W niektórych aminokwasach występują wiązania dwusiarczkowe. Te poprzeczne wiązania między łańcuchami bądź ich odcinkami tworzą się w wyniku utlenienie reszt cysteiny. Struktura II-rzędowa Jest to poziom określający sposób pofałdowania łańcucha peptydowego stabilizowane przez wiązania wodorowe tworzące się między regularnie rozłożonymi wiązaniami peptydowymi. Najważniejsze struktury to α-helisa i β- harmonijka (β- kartka), które nie obejmują całego łańcucha, lecz jego fragmenty. (mogą również tworzyć się struktury super drugorzędowe) •

α- helisa - Regularna struktura, powstaje przez spiralne prawoskrętne zwinięcie się łańcucha polipeptydowego wokół własnej osi, przypominająca prawo bądź lewoskrętną śrubę. Wiązania = i − układają się naprzeciw siebie, w odległości, która umożliwia utworzenie stabilizującego strukturę wiązania wodorowego. Na jeden skręt przypadają cztery takie wiązania. (Łańcuchy boczne wystają na zewnątrz α- helisy.)

•

β- harmonijka - Kształtem przypomina pofałdowaną (złożoną w harmonijkę) kartkę. Łańcuch polipeptydowy układa się na płaszczyźnie, wiązania wodorowe tworzą się międzyłańcuchami (oddalonymi od siebie wiązaniami peptydowymi.). Tworzą się zarówno struktury równoległe jak i antyrównoległe, oba występują w naturze i są dynamicznie równocenne.

Struktura III-rzędowa określa wzajemne przestrzenne położenie struktur drugorzędowych oraz lokalizację mostków disiarczkowych. Polega na skręcaniu się struktury białka, dzięki czemu reszty aminokwasów które są oddalone od siebie w II rzędnej strukturze, w III rzędowej znajdą się w bliskiej pozycji i między nimi będzie mogło dochodzić do oddziaływań, (fibrylarne nie posiadają tego poziomu struktury) Jest ona stabilizowana przez różne rodzaje wiązań (głównie między bocznymi ugrupowaniami aminokwasów): wodorowe, mostki siarczkowe, oddziaływania jonowe oraz oddziaływania Van der Waalsa. Struktura IV-rzędowa Jest to struktura białek podjednostkowych, składających się z więcej niż jednego łańcucha peptydowego, określając ich wzajemne położenie i rodzaj oddziaływań. Przykładem białka posiadającego strukturę IV rzędową jest hemoglobina – 4 łańcuchy polipeptydowe i 4 cząsteczki hemu. • Budowa wybranych białek: kolageny, α-keratyny, fibroiny Kolagen Występuje bardzo powszechnie, jest odpowiedzialny za prawidłowe budowanie ścięgien, artykulacji chrząstkowych, budowę dziąseł oraz ich wytrzymałość, odpowiada za wytrzymałość naczyń krwionośnych. Kolagen ma budowe lewoskrętnej helisy, w której co trzeci aminokwas to glicyna, a również częstym aminokwasem jest prolina która zapewnia rozciągliwość i usztywnienie, a reszty odpychają się, co sprawia że helisa kolagenu jest bardziej rozciągniętym strukturalnie białkiem od keratyny. Do struktury dojrzałego kolageny wchodzą wyjątkowe reszty aminokwasowe (wywodzące się od proliny i lizyny), są wbudowywane w kolagen gdy ten jeszcze nie osiągną stanu dojrzałego.

Hydroksyprliny oraz hydroksylizyny (Hyp i Hyl), tworzą wiązania kowalencyjne i wodorowe stabilizujące strukturę. Nie są to aminokwasy białkowe, ponieważ są wbudowywane do łańcucha jako reszty odpowiednich aminokwasów, potrzebują żelaza i witaminy C podczas uteniania jonu żelaza z 2 do 3 sotpnia, witamina C musi go z powrotem zredukować, bez hydroksylaz proces ten nie zajdzie prawidłowo a kolagen nie osiągnie formy dojrzałej. Kolagen to białko złożone które zawiera również reszty cukrowe dlatego jest nazywane glukoproteiną. Superhelisa kolagenu jest prawoskrętna, nie jest przypadkiem fakt iż co trzeci aminokwas to glicyna, jest ona perfekcyjnie dopasowana w zabudowie. Tutaj wiązania kowalencyjnne tworzą się dla mocniejszej odporności mechanicznej, wiązania te tworzą się między resztami lizyny, a dokładniej grupą aldehydowąlizyny z grupą aminowątworzą wiązanie podwójne / poprzeczne zwane również wiązaniami Schiffa, i są odpowiedzialne za silniejszą stabilizacje kolagenu. Sekwencja aminokeasowa -Gly - X - Y - Gly - X - Y - Gly - X - Y w której Y oznacza prolinę lub hydroksyprolinę α-Keratyna Są to białka budujące nasze włosy, paznokcie bądź wełnę u zwierząt. Ma kształt II-rzędowej αhelisy. W tym białku nie ma reszt aminokwasów tworzących wiązania, nie występuje w nim również prolina, a wiązania wodorowe mają miejsce między NH jednego i CO drugiego wiązania peptydowego, oddalonego o około 3 reszty. Za stabilizacje keratyny odpowiedzialne jest wytworzenie się jej struktury superhelikalnej, gdzie pojedyncze prawoskrętne helisy będą tworzyły lewoskrętną superhelise z licznymi wiązaniami Van der Waalsa. Za dodatkową stabilizacje oraz usztywnienie tej struktury odpowiedzialne jest również wytwarzanie się wiązań reszt czysteiny tworzących mostki disiarczane (Cys-S-S-Cys), im ich więcej tym sztywniejsze będzie białko. Fibriony Przykładem są fibriony jedwabiu. Fibriony mają kształt ꞵ-harmonijki. Łańcuchy boczne w tej strukturze nie tworzą żadnych oddziaływań, to znaczy, że w tworzeniu oddziaływań stabilizujących biorą udział tylko i wyłącznie ugrupowania wiązań peptydowych. • Białka osocza: albuminy, globuliny, fibrynogen Albuminy Albuminy to białka proste, dobrze rozpuszczają się w wodzie. Są głównym składnikiem osocza krwi odpowiedzialne w 15-85% za wywierane przez nie cisnienie onkotyczne. Dzieje się tak z uwagi na ich małą mase cząsteczkową i ich wysokiego stężenia. Jako jedne białka osocza nie są glikoproteinami i nie przechodzą kowalencyjnych modyfikacji poprzez dodawanie łańcuchów oligosacharydowych połaczaonych przez atomy azotu i/lub tlen. Syntetyzowana jest przez hepatocyty w formie preproalbuminy. Usunięcie jej peptydu sygnałowego w m omencie przechodzenia przez cysterny szorstkiej siateczki śródplazmatycznej prowadzi do powstania proalbuminy, a nastepnie wewnątrz pęcherzyków sekrecyjnych przekształcana jest do albumin przez furynę. Furyna jest enzymem, który usuwa heksapeptyd z pro albuminy tuz przy Ckońcu zasadowej di aminokwasowej sekwencji (argarg). Powstaje w taki sposób dojrzała albuminam która ulega sekrecji do surowicy. 1. Funkcja transportowa albuminy -białka transportują duże ilości hormonów (np. kortyzolu), leków (np.antybiotyków),witamin, kwasów tłuszczowych i lipidów. W przeciwieństwie do innych białek, albuminy są kluczowymi transporterami. Sód, magnez, potas czy cynk mogą wiązać się z albuminami i w takiej postaci przemieszczać się w organizmie. Odpowiedzialne są również za wiązanie i transport dwutlenku węgla. 2. Funkcja w postaci trzymania stałego ciśnienia onkotycznego- albuminy przede wszystkim utrzymują stałe ciśnienie onkotyczne w organizmie. Ma to na celu regulowanie ilości wody znajdującej się we krwi oraz zapobieganie jej przedostawaniu się z osocza do płynu tkankowego. Ciśnienie onkotyczne w pewnym stopniu równoważy ciśnienie hydrostatycznewe krwi i umożliwia przedostawanie się wody z elektrolitami pozanaczynia. Dzieje się tak z uwagi na ich małą mase cząsteczkową i ich wysokie stężenie . zapobiega to tworzeniu się obrzęków.

3. Funkcja buforowa (utrzymywanie stałego pH krwi) - albuminy wchodzą w skład buforowego układu krwi. Bufor białkowy (zawierający w największej ilości albuminy) odpowiedzialny jest utrzymywanie prawidłowego pH krwi, które powinno wynosić ok. 7,35-7,45. -Syntetyzowana jest przez hepatocyty w formie preproproteiny. Usunięcie jej peptydu sygnałowego w m omencie przechodzenia przez cysterny szorstkiej siateczki śródplazmatycznej prowadzi do powstania proalbuminy, a nastepnie wewnątrz pęcherzyków sekrecyjnych przekształcana jest do albumin przez furynę. -Dojrzała czastezcka albuminy składa sie z jednego łańcha polipeptydowego o długości 585 reszt aminokwasowych. Jest zorganizowana w 3 funkcjonalne domeny. Jej konformacja przestrzenna przyjmuje kształt elipsoidalny jest stabilizowana przez 17 wewnatrzłańcuchowych wiązań disiarczkowych. -Albuminy są odpowiedzialne za transport niespecyficzny. Ułatwiaja transport wolnych kwasów tłuszczowych, hormonów steroidowych, bilirubiny, cholesterolu, jonów i innych ligandów miedzy tkankami dzięki zawartości aminokwasów dwukarboksylowych oraz wysokiemu stężeniu stanowi układ o dużej pojemności wiążącej. -Albuminy osocza stanowią rezerwę białka w organizmie,wykorzystywaną podczas głodu i przy utracie białek w przebiegu różnych chorób. Są także odpowiedzialne za utrzymanie koloidalnego ciśnienia osmotycznego.. Mają małą zawartość tryptofanu. Utrzymują stałą objętość krwi i ciśnienie onkotyczne. Transportują kwasy tłuszczowe, stosowana do leczenia wstrząsu krwiotocznego, leczenie oparzeń. Globuliny Są to glikoproteiny, w których skład wchodzą wszystkie aminokwasy białkowe lecz kwas asparaginowy i kwas glutaminowy pojawiają się w większych ilościach . Syntetyzowane w wątrobie poza y-globulinami które są wytwarzane przez limfocyty. Przechodza kowalencyjne modyfikacje poprzez dodawanie lańcuchów oligosacharydowych polaczonych przez atomy azotui/lub tlenu, są źle rozpuszczalne w wodzie, natomiast dobrze w rozcieńczonych roztworach soli. Posiadają podobne właściwości do albumin Występują w dużych ilościach w płynach ustrojowych i tkance mięśniowej. Często zawierają składniki niebiałkowe: atomy metali, części sacharydowe i lipidowe; do ważniejszych globulin zwierząt należą: • immunoglobuliny (grupa białek o aktywności przeciwciał IgG, IgA, IgE ...), • globuliny krwi, m.in. białka biorące udział w krzepnięciu krwi (fibrynogen, protrombina, czynnik przeciwhemofilowy); • globulinami są także liczne enzymy, m.in. proteolityczne, fosfatazy, lipazy, amylaza i ureaza; • u roślin globuliny znajdują się np. w nasionach grochu, fasoli, soi. Immunoglobuliny wchodzące w skład γ-globulin dzielą się na pięć klas: IgG- są najliczniejszą klasą immunoglobulin; syntetyzowane pod wpływem stymulacji antygenam IgA- obecne we wszystkich wydzielinach; do ich syntezy dochodzi najczęściej przez błony śluzowe ogranizmu oraz błony surowicze; są one najliczniej syntetyznowanymi gamma globulinami, mimo że IgA nie jest we krwi główną frakcją; gamma globuliny A nazywanem są gamma globulinami wydzielniczymi; IgD- ich rola w ludzkim organizmie wciąż pozostaje niejasna, a ich lokalizacja to głównie powierzchnia limfocytów B; IgM- białka odpornościowe fazy wczesnej obrony organizmu IgE- przydatne w diagnostyce chorób pasożytniczych i pomocnicze w diagnostyce alergii.

Oprócz wyżej wymienionych klas w skład gamma globulin wchodzi również białko C-reaktywne, którego synteza zachodząca w wątrobie jest bardzo istotna dla utrzymania procesów odpornościowych.

Fibrynogen Fibrynogen jest glikoproteiną wielkocząsteczkową, składającą się z trzech par łańcuchów polipeptydowych: α, β oraz ɣ . Łańcuchy polipeptydowe połączone są między sobą za pomocą wiązań dwusiarczkowych. Okres półtrwania fibrynogenu w osoczu wynosi ok. 4 dni. Fibrynogen jest rozpuszczalnym białkiem osocza krwi produkowanym w wątrobie, zaliczanym do tzw. czynników krzepnięcia krwi. Fibrynogen jest niezbędny do powstawania skrzepu. W warunkach prawidłowych w przypadku, gdy dojdzie do uszkodzenia tkanek lub ściany naczynia, fibrynogen wraz z innymi produkowanymi w wątrobie czynnikami ulegają aktywacji inicjując kaskadę krzepnięcia (proces hemostazy). Skrzep fibrynowy powstaje wskutek szybko postępujących po sobie zdarzeń, które inicjowane są działaniem trombiny na łańcuchy Aα i Bβ fibrynogenu. Trombina wiąże się z fibrynogenem w centralnej części cząsteczki a następnie od końców aminowych łańcuchów Aα i Bβ fibrynogenu dochodzi do odszczepienia fibrynopeptydu A oraz wolnego odszczepienia fibrynopeptydu B. W wyniku tej reakcji tworzą są monomery fibryny, które wykazują zdolność polimeryzacji na drodze niekowalentnych interakcji, zachodzących pomiędzy domenami D i centralnymi domenami E kolejnych monomerów. Proces ten prowadzi do powstania protofibryli oraz grubych włókien (fibryli), Intensywność procesu bocznego łączenia się ze sobą włókien decyduje o wytrzymałości tworzącego się skrzepu. Enzym transglutaminazy to czynnik stabilizujący fibrynę i jest czynnikiem krzepnięcia krwi. Katalizuje on przy obecności jonów Ca 2+ jeden z ostatnich etapów reakcji w kaskadzie krzepnięcia krwi, tworząc wiązania między cząsteczkami fibryny, w wyniku czego powstaje nierozpuszczalny skrzep Fibrynogen zaliczany jest do czynników zwanych białkami ostrej fazy. Wzrost stężenia fibrynogenu oraz innych białek ostrej fazy we krwi odnotowuje się w przypadkach ostrych stanów zapalnych lub uszkodzeniach tkanek. • Zasady metod doświadczeń wykonywanych na ćwiczeniach ◦ Oznaczanie białka całkowitego w surowicy krwi metodą biuretową wg Weicheselbauma Metoda wykorzystuje zdolność do tworzenia barwnego kompleksu z jonami miedzi (II) z dwoma sąsiadującymi ze sobą wiązaniami peptydowymi. Reakcja zachodzi w środowisku alkalicznym w obecności winianu sodowo-potasowego, który jako czynnik kompleksujący utrzymuje jony miedzi (II) i zwiększa trwałość barwnego kompleksu. Intensywność zabarwienia jest zależna od ilości wiązań peptydowych, a powstały kompleks wykazuje maksimum pochłaniania przy λ = 550nm.

◦ Oznaczanie stężenia białka w moczu metodą Extona Oznaczenie opiera się o pomiar turbidymetrycznych. Turbidymetria jest jedną z metod analizy instrumentalnej, w której wykorzystuje się zjawisko rozprzaszania światła widzialnego. Polega na pomiarze wielkości, jaką jest zmętnienie wywołane wytrącenie analizowanej substancji z rostworu w postaci koloidalnej zawiesiny. Stopień zmętenienia jest wprost proporcjonalny z liczbą cząstek wywołujących mętność roztworu. Oznaczenie zawiesiny koloidalnej. Detektor jest umieszczony na jednej z linii z próbką i zródłem światła, dlatego tubidymeria nie różni się w zasadzię od absorpcjometrii i do jej celów można z pwodzeniem stosować zwykły absorpcjometr lub spektrofotometr. W metodzie Extona białko wytrąca się z materiału badanego roztworem kwasu sulfosalicylowego z Na2SO4. Intensywność powstałego zmętnienia określa się przy długości światła λ=445nm....