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Póster Sesión I.

Respuesta de test de germinación a la fitotoxicidad de sustancias orgánicas Response of germination tests to the phytotoxicity of organic substances 1

R. Paradelo 1, A.B. Moldes 1,2, D. González 1, M.T. Barral 1 Departamento de Edafoloxía e Química Agrícola, Facultade de Farmacia, Universidade de Santiago, 15782 Santiago de Compostela, España 2 Departamento de Enxeñería Química, Facultade de Ciencias, Campus As Lagoas, 32004 Ourense, España E-mail: [email protected]

Palabras clave: ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, etanol, compost. Keywords: acetic acid, propanoic acid, butyric acid, ethanol, compost. Resumen Los test de fitotoxicidad basados en la germinación y elongación de semillas en extractos acuosos de compost han sido ampliamente utilizados durante las últimas décadas, si bien de modo empírico porque los resultados son difíciles de relacionar con factores fitotóxicos concretos. Con el fin de conocer exactamente como responden las semillas a distintas sustancias orgánicas fitotóxicas presentes habitualmente en compost inmaduro (ácidos acético, propiónico y butírico, y etanol), se realizaron dos modalidades de test de fitotoxicidad con disoluciones acuosas de compuestos orgánicos. Las concentraciones utilizadas fueron: 50-300 mg L-1 para los ácidos acético y propiónico, 5-50 mg L-1 para ácido butírico, y 1-10 g L-1 para etanol. Se emplearon semillas de tres especies: berro (Lepidium sativum L.), raygrás italiano (Lolium multiflorum Lam.), y cebada (Hordeum vulgare L.), incubando las semillas en placas Petri con la correspondiente disolución durante cinco días a 25ºC. En uno de los dos métodos se realizó una inmersión previa de las semillas en la disolución evaluada para ver el efecto producido en los resultados por un mejor contacto con la sustancia fitotóxica. El berro resultó ser la especie más sensible a estos compuestos orgánicos. Las concentraciones fitotóxicas para cada sustancia fueron las siguientes: 100 mg L-1 para ácido acético, 100 mg L-1 para ácido propiónico, 50 mg L-1 para ácido butírico y 2 g L-1 para etanol. La imbibición aumentó la sensibilidad del test en algunos casos. Abstract Phytotoxicity tests based on the germination of seeds have been widely used during the last decades for evaluating the phytotoxicity of compost extracts. Nevertheless, the results of these tests are difficult to attribute to a specific property of the evaluated material, so if a phytotoxic effect of a certain material is observed, further investigations must be carried out to identify the specific cause. In this work, the phytotoxic properties of organic substances commonly present in immature compost, have been tested. A germination-elongation phytotoxicity test was carried out with aqueous solutions of acetic, propanoic and butyric acids, and ethanol, and the results were compared to those of a second test in which a previous step of soaking of the seeds in the tested solutions was introduced. The concentrations tested were 50-300 mg L-1 for acetic and propanoic acids, 5-50 mg L-1 for butyric acid, and 1-10 g L-1 for ethanol. Three species were used: Hordeum vulgare L (spring barley), Lolium multiflorum Lam. (Italian ryegrass) and Lepidium sativum L. (garden cress), and the seeds moistened with the tested solution were incubated in Petri dishes during five days at 25ºC in the dark. Cress was the most sensitive species to all the substances used, and the phytotoxic concentrations were found to be near 100 mg L-1 for acetic acid, 200 mg L-1 for propanoic acid, 50 mg L-1 for butyric acid, and 2 g L-1 for ethanol. The soaking step had a positive effect on the sensitivity of the test in some cases.

I Jornadas de la Red Española de Compostaje

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Póster Sesión I. 1. Introducción La mayoría de los usos a los que se destina el compost implican su contacto con plantas, por lo que conocer sus posibles efectos negativos sobre el desarrollo vegetal es fundamental. Aunque la presencia de sustancias potencialmente inhibidoras del crecimiento vegetal se puede evaluar mediante determinaciones químicas, la evaluación directa mediante pruebas de germinación y/o crecimiento de plantas tiene una serie de ventajas que hacen que este tipo de ensayos esté muy extendido. La principal es que pueden medir el efecto combinado de las propiedades físicas, químicas y bioquímicas del compost sobre el desarrollo vegetal, teniendo en cuenta los posibles efectos sinérgicos. Frente a las pruebas de crecimiento de plantas, los test de germinación con extractos presentan la ventaja adicional de la rapidez de la determinación, aunque presentan algunos problemas de repetibilidad. Por ejemplo, Wierzbick y Obidzinska (1998) observaron que, en test de fitotoxicidad realizados en placas Petri, el patrón de penetración del Pb en las semillas era muy irregular, afectando significativamente a los resultados del test, y que la inmersión previa de las semillas en la disolución incrementaba la permeabilidad de la membrana mejorando los resultados. Siguiendo estas observaciones, en un trabajo previo observamos que la imbibición previa en la disolución evaluada mejoraba la respuesta del test de germinación a los metales pesados, debido a un mejor contacto con la sustancia fitotóxica y a la mayor cantidad de ésta (Villada et al., 2007). Las causas de la fitotoxicidad que presentan algunos composts son diversas, y entre ellas están la existencia de sustancias orgánicas de bajo peso molecular, además de un exceso de salinidad o metales pesados. Durante la descomposición de la materia orgánica fresca se producen ácidos orgánicos de bajo peso molecular, que han sido encontrados en composts de diversos orígenes y a los que se atribuyen efectos fitotóxicos (Pascual et al., 1997; Himanen et al., 2006). En el suelo otros ácidos orgánicos son producidos de manera natural por las raíces, especialmente en situaciones de falta de nutrientes o toxicidad por Al, principalmente ácido cítrico, málico y oxálico (Jones, 1998). Sin embargo, ha sido demostrado que los de más bajo peso molecular, acético, propiónico y butírico, inhiben el crecimiento de las raíces y afectan a la nutrición de las plantas, reduciendo la absorción de P, K, Si, Mg, Ca y NH4-N. Estos ácidos orgánicos dañan a las raíces produciendo una lignificación anormal de la pared celular, entre otros efectos, lo que impide la absorción de nutrientes y dificulta la difusión de oxígeno (Armstrong y Armstrong, 1999). La fitotoxicidad de estos tres compuestos ha sido evaluada en este trabajo, así como la del etanol, por ser muy común su presencia en residuos orgánicos de origen agrícola, como por ejemplo el orujo de uva. Dada la importancia de algunos compuestos orgánicos como indicadores de la madurez del compost, los objetivos de este trabajo fueron: (1) observar el efecto fitotóxico de varias sustancias orgánicas mediante test de germinación; y (2) comprobar si la imbibición previa de las semillas da lugar a un aumento de la sensibilidad del test. 2. Materiales y métodos Se utilizaron dos tests de germinación para determinar la fitotoxicidad de las disoluciones correspondientes de sustancias orgánicas, usando tres especies: berro (Lepidium sativum L.), cebada (Hordeum vulgare L.) y raygras italiano (Lolium multiflorum Lam.). Se prepararon disoluciones de los compuestos orgánicos correspondientes, con las siguientes concentraciones: 5, 10, 25 y 50 mg L-1 de ácido butírico; 50, 100, 200 y 300 mg L1 de ácido acético y propiónico; y 1, 2, 5 y 10 g L-1 de etanol, teniendo en cuenta los rangos de concentración que pueden encontrarse en residuos orgánicos compostados que no han alcanzado una madurez completa. En el primer test se dispusieron veinte semillas de cada especie en placas Petri de 9 cm, sobre un papel de filtro, por triplicado, y se les añadieron 3 mL de la disolución correspondiente. En el segundo, se introdujo un paso previo de imbibición: las semillas fueron sumergidas en 50 mL de cada disolución durante 24 h, y a continuación se realizó el test de germinación del modo descrito. Las placas Petri se cubrieron para evitar la evaporación y se incubaron en la oscuridad a 25ºC durante cinco días. Se anotó el número de semillas germinadas y la longitud de las raíces, para calcular el índice de germinación (GI) como sigue: I Jornadas de la Red Española de Compostaje

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Póster Sesión I.

GI = 100 x

G L x GC L C

donde G y L son el número de semillas germinadas y la longitud de la raíz para cada disolución testada, y GC y LC el número de semillas germinadas y la longitud de la raíz en el control (agua destilada). 3. Resultados y discusión Los resultados de los test de germinación se muestran en las figuras 1 a 3. Con escasas excepciones, los valores de GI se redujeron con concentraciones crecientes de la sustancia fitotóxica, para todos los compuestos y especies. La posibilidad de que el efecto fitotóxico observado se deba al pH y no a los ácidos en sí se descartó germinando semillas en agua acidificada con HCl a pH 4 (las diferentes disoluciones de ácidos presentaron un pH en torno a este valor), obteniéndose los mismos resultados que en los controles germinados en agua destilada. Ácido propiónico

Ácido acético 140 120 100 GI

140 120 100

80 60 40 20 0

GI

50

100

200

80 60 40 20 0

300

50

100

mg/L Ácido butírico

GI

200

300

5

10

mg/L Etanol

140 120 100 80

140 120 100 GI

60 40 20 0 5

10

25

50

mg/L

80 60 40 20 0 1

2 g/L

Figura 1. Resultados de los test de germinación con berro. Las columnas oscuras representan los resultados del test con imbibición. Las barras de error representan dos veces la desviación estándar.

El berro fue claramente más sensible que las otras especies a todas las sustancias evaluadas. Las semillas de esta especie fueron más sensibles a los ácidos acético y propiónico tras la imbibición, mientras que ésta no tuvo efecto en los resultados de ácido butírico y etanol. El raygrás italiano fue algo menos sensible que el berro, y la imbibición sólo produjo un incremento de la sensibilidad en el caso del ácido propiónico. La sensibilidad al ácido butírico fue menor que la de las otras especies. La cebada fue la especie más resistente, lo cual contradice la opinión general de que esta especie es un buen indicador de inmadurez por ser sensible a este tipo de compuestos orgánicos.

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Póster Sesión I. Ácido acético

Ácido propiónico

140

140

120

120

100 GI

100

80

GI

60

80 60

40

40

20

20

0

0 50

100

200

300

50

100

mg/L

200

300

5

10

mg/L

Ácido butírico

Etanol 140

160 140 120 100

120 100

GI 80 60 40 20

GI

80 60 40 20 0

0 5

10

25 mg/L

50

1

2 g/L

Figura 2 Resultados de los test de germinación con cebada. Las columnas oscuras representan los resultados del test con imbibición. Las barras de error representan dos veces la desviación estándar.

La evaluación de los niveles de fitotoxicidad se realizó tomando como referencia un valor de GI inferior a 80, indicativo de fitotoxicidad moderada según Zucconi et al. (1981). De acuerdo con este límite, las concentraciones a partir de las cuales se observaron efectos fitotóxicos fueron 50 mg L-1 para ácido acético (test con imbibición en berro y raygrás, aunque el efecto fue más claro en berro), 100 mg L-1 para ácido propiónico (test con imbibición en berro y raygrás, también con efecto más pronunciado en el primero), 5 mg L-1 para ácido butírico (test con imbibición en berro), y 1 g L-1 para etanol (test sin imbibición con berro). En cambio, si tomamos como valor indicativo de fitotoxicidad un GI de 50 (Emino y Warman, 2004), los resultados serían los siguientes: 100 mg L-1 para ácido acético (test con imbibición con berro), 200 mg L-1 para ácido propiónico (test con imbibición en berro y raygrás), 50 mg L-1 para ácido butírico (test sin imbibición con berro), y 2 g L-1 para etanol (test sin imbibición con berro). Armstrong y Armstrong (1999) indicaron que la fitotoxicidad de varios ácidos (entre ellos los estudiados en este trabajo) se puede situar en concentraciones torno a 1-1,5 mM de la forma sin disociar, siendo el ácido propiónico el más fitotóxico para estos autores. Esto significaría para todos los ácidos concentraciones en torno a 100 mg L-1, lo que coincidiría con nuestras observaciones si tomamos como umbral de fitotoxicidad un valor de GI inferior a 50. Esto, unido a la menor variabilidad, en general, de los resultados correspondientes a valores bajos de GI, nos lleva a recomendar este valor como un indicador más fiable de la fitotoxicidad.

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Póster Sesión I. Ácido acético

GI

Ácido propiónico

140

140

120

120

100

100

80

GI

60 40

80 80 60 60 40 40 20 20

20 0

0 50

100

200

300

50

100

mg/L Ácido butírico

GI

200

300

5

10

mg/L Etanol

140

140

120

120

100

100

80 GI

60

80 60

40

40

20

20

0

0 5

10

25 mg/L

50

1

2 g/L

Figura 3 Resultados de los test de germinación con raygrás italiano. Las columnas oscuras representan los resultados del test con imbibición. Las barras de error representan dos veces la desviación estándar.

Himanen et al. (2006) obtuvieron las siguientes concentraciones de ácidos carboxílicos en compost inmaduro de lodos: 5 mg kg-1 de ácido butírico, 15 mg kg-1 de ácido propiónico y 1000 mg kg-1 para ácido acético. Teniendo en cuenta que para la evaluación de la fitotoxicidad se usa una relación sólido:líquido 1:10, los extractos de estos compost darían concentraciones en disolución de 0,5 mg L-1 para ácido butírico, 1,5 mg L-1 para ácido propiónico y unos 100 mg L-1 para ácido acético. De acuerdo con los resultados de nuestro estudio, las cantidades de ácido propiónico y butírico serían demasiado bajas para dar una respuesta fitotóxica, mientras que las de ácido acético podrían ser consideradas fitotóxicas. Pascual et al. (1997) publicaron valores considerablemente menores para estos mismos ácidos en compost inmaduros de RSU y lodos, que presentarían 150-200 mg kg-1 de ácidos acético y butírico, y 50 mg kg-1 de ácido propiónico, valores que no podrían dar lugar a fitotoxicidad. También observaron que las concentraciones son mucho más bajas en compost maduros (< 10 mg kg-1),. Aunque estas concentraciones no son suficientes para producir fitotoxicidad en los test de germinación, habría que tener también en cuenta el efecto aditivo de todos los ácidos presentes, que no ha sido considerado en este trabajo. 4. Conclusiones Se demostró la respuesta fitotóxica de etanol y tres ácidos orgánicos de cadena corta en ensayos de germinación con tres especies vegetales (berro, cebada y raygrás), de los cuales el más sensible fue el berro (Lepidium sativum L.). Entre las sustancias testadas, el ácido butírico parece ser la más tóxica. La sensibilidad del test de germinación mejoró en algunos casos mediante un paso de imbibición previa. Las semillas parecen ser más sensibles al contacto previo con las moléculas más pequeñas y ácidas (acético y propiónico), mientras que la imbibición no produjo efectos sobre la respuesta a etanol y ácido butírico. 5. Referencias Armstrong, J. y Armstrong, W. 1999. Phragmites die-back: toxic effects of propionic, butyric and caproic acids in relation to pH. New Phytol. 142, 201-217. Emino, E.R. y Warman P.R. 2004. Biological assay for compost quality. Compost Sci. Util. 12, 342-348. I Jornadas de la Red Española de Compostaje

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Póster Sesión I. Himanen, M., Latva-Kala, K., Itävaara, M. y Hänninen, K. 2006. A method for determining low-weight carboxylic acids from biosolid compost. J. Environ. Qual. 35, 516-521. Jones, D.L. 1998. Organic acids in the rizosphere - a critical review. Plant Soil 205, 25-44. Pascual, J.A., Ayuso, M., García, C. y Hernández, T. 1997. Characterization of urban wastes according to fertility and phytotoxicity parameters. Waste Manage. Res. 15, 103-112. Villada, A., Paradelo, R., Moldes, A.B. y Barral, M.T. 2007. Effect of seed imbibition in the response of a germination-elongation test to heavy metals. Proceedings of the International Meeting “Soil and Wetland Ecotoxicology”. Barcelona 26-27 de noviembre de 2007. Wierzbicka, M.J. y Obidzinska, J. 1998. The effect of lead on seed imbibition and germination in different plant species. Plant Sci. 137, 155-171. Zucconi, F., Forte, M., Monaco, A. y De Bertoldi, M. 1981. Biological evaluation of compost maturity. BioCycle 22, 27-29.

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