Practica 10 - análisis cuantitativo de enzimas PDF

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PRÁCTICA #10: Analisis cuantitativo de enzimasEQUIPOASIGNATURA: Proceso MetabolicosLICENCIATURA: Q.FRESUMENLa catalasa es una enzima antioxidante presente en la mayoría de los organismos aerobios. Enzimas son homotetrámeros con un grupo hemo en cada subunidad. Se ha determinado la estructura crista...

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PRÁCTICA #10: Analisis cuantitativo de enzimas

EQUIPO #4 ASIGNATURA: Proceso Metabolicos

LICENCIATURA: Q.F.BT

RESUMEN La catalasa es una enzima antioxidante presente en la mayoría de los organismos aerobios. Enzimas son homotetrmeros con un grupo hemo en cada subunidad. Se ha determinado la estructura cristalogrfica de nueve catalasas. Algunas catalasas tienen subunidades pequeñas y otras grandes. Entre estos dos tipos de catalasas existen diferencias estructurales importantes. Las catalasas pequeñas son menos resistentes a la desnaturalización, unen NADPH, tienen hemo b y se inhiben e inactivan por sustrato. En cambio, las catalasas grandes tienen un dominio extra en el C-terminal que es semejante a la flavodoxina, son muy resistentes a la desnaturalización, tienen hemo d, presentan enlaces covalentes inusuales cercanos al sitio activo y son resistentes a concentraciones molares de H2O2. Aquí revisamos los aspectos estructurales de las catalasas y sus posibles implicaciones funcionales. PALABRAS CLAVE: Enzimas, anlisis, vio moléculas catalasa.

INTRODUCCIÓN Son proteínas llamadas enzimas las que afectan como catalizadores biológicos, con pesos moléculas del orden de 106 a 1012 lo que permite que se lleve a cabo a la temperatura corporal y reacciones que de otro modo serían imposibles. La acción de las enzimas se describe en términos de llave y cerradura. La enzima para actuar por una reacción en particular debe de ajustar con precisión a la molécula sobre la cual ajusta. Son catalizadoras de reacciones bioquímicas sin alterar el punto de equilibrio de la reacción o sin ser consumidas o experimentar algún cambio en su composición. Las otras sustancias de la reacción son convertidas a producto. Propiedades generales Como canalizan diferentes biomoléculas y por ser una proteína tiene una secuencia de aminocidos especifica. • Estructura primaria • Estructura secundaria • Estructura terciaria • Estructura cuaternaria Cada enzima tiene un sitio activo a menudo una cavidad sin agua, donde el sustrato interactúa con los residuos de aminocidos. Sitio alostérico puede enlazar moléculas reguladoras y por tanto ser significativo para la estructura enzimtica bsica. Cada enzima puede existir en diferentes formas dentro del individuo y pueden diferenciarse por sus propiedades físicas, como movilidad electroforética, solubilidad, o resistencia a desactivación. Isoforma-enzima est sujeta a modificaciones postralacionales.

Isoenzima y las isoformas contribuyen a la heterogeneidad en las propiedades y función de las enzimas. Cofactor: unidad no proteica unida a la enzima (activadores) Coenzima: factor orgnico Cuando une una coenzima a una enzima se le llama grupos prostético. La porción de enzima con su respectiva coenzima, forman un sistema de completa actividad, haloenzimtica.

OBJETIVOS  

Determinar la presencia de enzimas en productos de origen animal o vegetal mediante reacciones químicas específicas. Identificar la acción de la catalasa, peroxidasa y tirosinasa

HIPÓTESIS Mediante las pruebas de catalasa, peroxidasa, tirosidasa, se podr determinar la presencia de enzimas de origen animal o vegetal en productos como papa cruda, zanahoria, tomate, jugo de limón y carne.

METODOLOGÍA 1. Reconocimiento de la catalasa Pesar 1 g de cada tejido a analizar

Introducir cada tejido pesado en un tubo de ensayo

Añadir 5 ml de H2O2 a cada tubo

Registrar observaciones de mayor a menor actividad en cada tejido Identificar tejido observaciones

más

reactivo

y

realizar

esquema

de

2. Desnaturalización de la catalasa Pesar 1 g de g de cada tejido a analizar

Introducir cada tejido pesado en un tubo de ensayo

Introducir los tubos con tejidos en baño de agua hirviendo durante 10 min

Añadir 5 ml de H2O2 a cada tubo

Registrar observaciones de mayor a menor actividad y comparar resultados con experimento anterior

3. Determinación de la peroxidasa a) Prueba Bencidina Pesar aprox. 2 g de Rabano

Triturar tejido agregando 3 ml de H2O

Filtrar a través de gasa

Agregar 2 gotas de H2O2 al 0.5% y agitar suavemente

Añadir 5 gotas de solución alcoholica de Bencidina

Agregar 1 ml de extracto acuoso a tubo de ensayo

Anotar resultados

b) Prueba de Pirogalol

Rallar un papa fresca

Tomar una pequeña cantidad de la ralladura sin exprimir

Colocar en tubo de ensayo

Anotar resultados

Observar aparición precipitado

Añadir 1 ml de Pirogalol al 1% y 2 gotas de H2O2 al 2%

la de

4. Determinación de Tirosinasa

Rallar papa fresca

Exprimir por medio de gasa doble

Filtrar inmediatamente extracto en embudo

Mezclar y colocar el tubo en baño de agua a 40°C

Añadir 3 gotas de solución de tirosina

Vaciar a tubo ensayo 1 ml extracto

Agitar tubo cada 2 min

Observar y anotar los cambios de coloración

RESULTADOS

un

de de

Resultados Reconocimiento de la catalasa

Desnaturalización de la catalasa

Determinación de la peroxidasa Bencidina

Determinacion de Tirosinasa

Pirogalol

DISCUSIÓN La enzima catalasa es una enzima antioxidante que puede catalizar la conversión de peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. Todas las enzimas son proteínas. Por lo tanto, todas las enzimas sufren desnaturalización frente al calor. Esto quiere decir que cuando la temperatura es muy elevada, la enzima pierde su estructura terciaria, por lo tanto su sitio activo también se desnaturaliza, y ya no puede cumplir su función. A nivel celular la catalasa se localiza en las mitocondrias y los peroxisomas, excepto en los eritrocitos, donde se encuentra en el citosol.

Esta enzima puede actuar como una peroxidasa para mucha sustancias orgnicas, especialmente para el etanol que actúa como donante de hidrógeno. Las enzimas de muchos microorganismos, como el Penicillium simplicissimum que exhiben actividad de catalasa y peroxidasa, son frecuentemente llamadas catalasas-peroxidasas. Las peroxidasas son un tipo de enzimas muy extendidas en toda la escala filogenética. Catalizan reacciones bisustrato de carcter redox, utilizando un peróxido como oxidante y un segundo sustrato de características reductoras que es oxidado por el peróxido. La peroxidasa est ms presente en los vegetales como el ‘’rbano’’, y est ms escasa en los tejidos animales, pero presente de manera defensiva en la saliva, leche o leucocitos. Los sustratos de la peroxidasa son los fenoles, amilo fenoles, diaminas, el sustrato ms usado es el ‘’Guayacol’’. Algunos de los factores que influyen en la reacción de la peroxidasa es la temperatura alta, ya que la inactiva debido a que la peroxidasa es una enzima termoestable. El producto de la reacción de la peroxidasa es la ‘’quinona’’. Y es responsable de la modificación de color, sabor, textura, desarrollando olores y sabores extraños y esto se controla con la aplicación de altas temperaturas para inactivar la enzima En la superficie se comenzó a formar una coloración café oscuro, a este acontecimiento se le denomina pardeamiento, y es causado por la acción de la enzima tirosinasa sobre el aminocido tirosina, la cual usando como sustrato al oxigeno molecular modifica a la tirosina en dopa, dopacromo y dopaquinona (café oscuro) y finalmente se forma el pigmento oscuro llamado melanina.

CONCLUSIÓN La temperatura es un factor importante en la actividad enzimtica. Se puede decir que a mayor temperatura aumenta la velocidad de la reacción hasta que llega un punto en el que la velocidad disminuye con el aumento en el calor. Los agentes precipitantes inhiben la actividad enzimtica por desnaturalización de la enzima

CUESTIONARIO Investigar: Importancia de las enzimas en el metabolismo celular. Reacciones que catalizan las enzimas analizadas Sin catlisis, las reacciones químicas que como la de la oxidación de la sacarosa, son necesarias para mantener la vida. Los catalizadores de las recciones en los sistemas biológicos: las enzimas, poseen un gran poder catalítico, a menudo muy superior al de los catalizadores sintéticos o inorgnicos. Poseen un elevado grado de especificidad respecto a sus sustratos, aceleran espectacularmente las reacciones químicas específicas y funcionan en soluciones acuosas en

condiciones muy suaves de temperaturas y pH. Hay pocos catalizadores no biológicos que tengan dichas propiedades antes mencionadas. Las enzimas estn en el centro de todos los procesos bioquímicos, actúan en secuencias organizadas en las que se degradan moléculas de nutrientes, se conserva y transforma la energía química y se fabrican macromoléculas biológicas partir de precursores sencillos. A través de la acción de las enzimas reguladoras, los sistemas enzimticos se coordinan de un modo muy eficaz, permitiendo una integración armoniosa de la multitud de actividades metabólicas diferentes que son necesarias para la vida. El estudio enzimtico también tiene importancia prctica inmensa, en algunas enfermedades, especialmente en las que son genéticamente heredables, puede haber una deficiencia o incluso una ausencia total de uno o ms enzimas. Puede ser que también se produzcan situaciones anormales por la actividad excesiva de una enzima especifica. La medición de la actividad enzimtica en el plasma sanguíneo, eritrocitos o muestras de tejido son importantes en el diagnostico de enfermedades. Muchos frmacos ejercen efectos biológicos a través de la interacción con enzimas. Las enzimas se han convertido en herramientas prcticas importantes, no solo en medicina sino también en la industria química, en el tratamiento de los alimentos y en la agricultura. La catalasa es una enzima que se encuentra presente en muchos organismos vivos y que cataliza la reacción de descomposición del peróxido de hidrogeno en agua y oxígeno. Su función es proteger a las células del efecto tóxico del peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) producido en distintas reacciones redox Cataliza la reacción: 2 H2O2 -----------> 2 H20 + O2 El peróxido es uno de los productos del metabolismo celular en diversos organismos, pero debido a su toxicidad es transformado por la enzima catalasa. Al igual que en el organismo, la catalasa ha sido utilizada en la industria como en la textil para la eliminación de residuos de peróxido de hidrogeno. Las especies de oxígeno reactivas como el radical superóxido, el radical hidroxilo y el peróxido de hidrógeno (H2O2) se forman durante la reducción del dioxígeno en agua. Estas especies pueden dañar las proteínas, los lípidos y los cidos nucleicos, por lo que se requieren sistemas antioxidantes eficientes, entre los que se incluyen ciertas enzimas. El peróxido de hidrógeno se forma por la dismutación del radical superóxido y también en la reacción de algunas oxidasas. Hay varias enzimas capaces de degradar el peróxido de hidrógeno: las catalasas, las peroxidasas y las peroxirredoxinas. Las peroxidasas eliminan el H2O2 usndolo para oxidar otros sustratos. A diferencia de las otras enzimas, que requieren de un sustrato reducido, las catalasas dismutan el peróxido de hidrógeno.

Se han identificado tres grupos de catalasas: a) Las catalasas mono funcionales, que contienen hemo y estn presentes tanto en los organismos procariotas como en los eucariotas. b) Las Mn-catalasas, que son enzimas hexaméricas que no tienen hemo, tienen Mn en el sitio activo y sólo estn presentes en algunos organismos procariotas anaerobios c) Las catalasas-peroxidasas, que tienen actividad de catalasa y de peroxidasa, contienen hemo y sólo estn presentes en las bacterias y los hongos Las catalasas catalizan la dismutación del peróxido de hidrógeno en agua y dioxígeno evitando así que se forme el radical hidroxilo y especies de oxígeno que son muy reactivas. En el hombre, la catalasa protege la hemoglobina del peróxido de hidrógeno que se genera en los eritrocitos. [ CITATION Día03 \l 2058 ] La catalasa cumple una función protectora contra determinados microorganismos patógenos (anaerobios). Las bacterias anaerobias, mueren al estar en contacto con oxígeno, debido a esto el oxigeno producido por esta enzima tiene efecto bactericida sobre dichos microorganismos. Tanto es así, que la ausencia de dicha enzima por defectos genéticos, llamada acatalasemia o enfermedad de Takahara, causa importantes infecciones en la mucosa bucal, pudiendo llegar a causar la perdida de dientes y graves lesiones en maxilares y tejidos blandos de la actividad bucal. Mecanismo de reacción de la catalasa En la reacción de la catalasa ocurre la transferencia de dos electrones entre dos moléculas de peróxido de hidrógeno en la cual una funciona como donador y otra como aceptor de electrones. El mecanismo de reacción se lleva a cabo en dos pasos. En el primero la catalasa se oxida por una molécula de peróxido formando un intermediario llamado compuesto I. El compuesto I se caracteriza por tener un grupo ferroxilo con FeIV y un radical catiónico de porfirina. En esta reacción se produce una molécula de agua. En el segundo paso de la reacción, el compuesto I es reducido por otra molécula de peróxido regresando la catalasa a su estado inicial y produciendo agua y dioxígeno. En ciertas condiciones el compuesto I puede captar un electrón originando el compuesto II. El compuesto II tiene un estado de oxidación intermedio a los observados en el compuesto I y la catalasa en reposo. Al reaccionar con una molécula de H2O2 forma el compuesto III, que tiene un estado de oxidación FeVI. El compuesto II y el compuesto III son inactivos catalíticamente. La catalasa también puede catalizar ciertas reacciones como peroxidasa. En la reacción de peroxidasa de la catalasa, el compuesto I puede oxidar el metanol, el etanol o el nitrato utilizando una molécula de H2O2 como oxidante. En el cerebro, la reacción

de la catalasa con el etanol forma acetaldehído que explica algunos de los efectos neurológicos del alcohol en humanos. [ CITATION Día03 \l 2058 ]

La tirosinasa (monofenol mono oxigenasa) es una enzima que cataliza la oxidación de fenoles (como la tirosina) y est extendida en plantas y animales. La tirosinasa es una enzima cuprífera presente en tejidos de plantas y animales que cataliza la producción de melanina y otros pigmentos de la tirosina por oxidación, como el ennegrecimiento de una patata pelada o cortada expuesta al aire. La tirosinasa lleva a cabo la oxidación de fenoles como la tirosina y el catecol usando dioxígeno (O2). En presencia de catecol, se forma benzoquinona, los hidrógenos extraídos del catecol se combinan con el oxígeno para formar agua. Los dos tomos de cobre dentro del sitio activo de las enzimas de tirosinasa reaccionan con dioxígeno para formar un intermedio químico altamente reactivo que entonces oxida el sustrato. La actividad de la tirosinasa es similar a la catecol oxidasa, una clase relacionada de oxidasa de cobre. Las tirosinasa y las catecol oxidasas se llaman colectivamente polifenol oxidasas.

Investigar: fundamento de las pruebas realizadas. Factores que alteran la actividad enzimática. Prueba Bencidina; Fundamento Las peroxidasas sanguíneas son catalasas que poseen actividad catalítica (enzimtica) en las reacciones de oxidación, ya que tienen la propiedad de descomponer el peróxido de hidrógeno u otros peróxidos orgnicos, produciendo liberación de radicales oxhidrilo según la siguiente rección: H2O --> H -- OH + O

El grupo hem de la hemoglobina posee esa actividad enzimtica, que puede catalizar la ruptura del peróxido de hidrógeno. Mientras no estén presentes otras sustancias orgnicas oxidantes, esta actividad de la hemoglobina, descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, que al reaccionar con la bencidina la oxidarn formando un compuesto intensamente azul. La oxidación de la bencidina es utilizada como prueba presuntiva para la identificación de sangre. La técnica tiene una sensibilidad de 1,300,000 a 500,000. Un resultado negativo excluye la presencia de sangre; si la reacción es positiva

requiere, como toda técnica de orientación del empleo de reacciones de confirmación ya que se pueden tener falsas reacciones positivas con otras sustancias que tengan actividad semejante a las de las peroxidasas o bien con otros materiales oxidantes. Prueba Pirogalol La polifenol oxidasa de la papa ataca a los siguientes compuestos en orden de mayor a menor actividad: cido clorhídrico, catecol, quercetina, pirogalol, acido cafeico, 3,4-dihidroxifenilalanina, p-creso, tirosina entre otros. Las quinonas resultantes de la reacción de la polifenol oxidasa pueden continuar oxidndose y polimerizndose, para dar compuestos finales que son muy complejos y coloridos. Es difícil distinguir las actividades de las dos enzimas a partir de la misma fuente, ya que pueden atacar a los mismos substratos, sin embargo utilizando papa como fuente de las enzimas, la reacción de la peroxidasa es mucho ms rpida, cosa que puede permitir la observación de las dos acciones. Determinación de Tirosinasa La tirosinasa (monofenol mono oxigenasa) es una enzima que cataliza la oxidación de fenoles (como la tirosina) y est extendida en plantas y animales. La tirosinasa es una enzima cuprífera presente en tejidos de plantas y animales que cataliza la producción de melanina y otros pigmentos de la tirosina por oxidación, como el ennegrecimiento de una patata pelada o cortada expuesta al aire. La tirosinasa lleva a cabo la oxidación de fenoles como la tirosina y el catecol usando dioxígeno (O2). En presencia de catecol, se forma benzoquinona, los hidrógenos extraídos del catecol se combinan con el oxígeno para formar agua. Los dos tomos de cobre dentro del sitio activo de las enzimas de tirosinasa reaccionan con dioxígeno para formar un intermedio químico altamente reactivo que entonces oxida el sustrato. La actividad de la tirosinasa es similar a la catecol oxidasa, una clase relacionada de oxidasa de cobre. Las tirosinasa y las catecol oxidasas se llaman colectivamente polifenol oxidasas. Factores que alteran la actividad enzimtica Algunos factores que influyen en la actividad de las enzimas son: •Cofactores y coenzimas •Temperatura •pH •Concentración del sustrato •Inhibidores •Mecanismos reguladores

Reportar la actividad enzimática de la catalasa en los diferentes tejidos analizados. Listar en orden de mayor a menor actividad.

Tejido Papa

Rábano

Carne Res

Actividad Gran nivel de actividad, la producción de efervescencia sobrepasa la capacidad del tubo de ensayo; gran nivel de descomposición de peróxido en agua y oxígeno. Reacción (+++++) Producción de efervescencia grande; no sobrepasa capacidad de tubo de ensayo, pero la descomposición de peróxido es grande. Reacción (++++) Efervescencia a 2/4 del tubo de ensayo, se puede apreciar descomposición, pero no iguala a la del rbano o a la de la papa.

Carne Pollo Zanahoria

Tomate (verde)

Limón

Tejido con cometimiento a calor (desnaturalización de Catalasa) Papa Rábano Carne Res Carne Pollo Zanahoria

Reacción (+++) Reacción a ¼ de capacidad de tubo de ensayo. Producción mínima. Reacción (++) Efervescencia únicamente en superficie de peróxido, liberación muy baja de O2 y H2O Reacción (+) Efervescencia únicamente en superficie de peróxido, liberación muy baja de O2 y H2O Reacción (+) Efervescencia nula Sin producción de H2O y O2. Reacción(-)

Actividad Sin presencia de O2 y H2O Sin presencia de O2 y H2O Sin presencia de O2 y H2O Sin presencia de O2 y H2O Sin presencia de O2 y H2O

Tomate (verde) Limón

Sin presencia de O2 y H2O Sin presencia de O2 y H2O

Interpretar y discutir los resultados en función de la eficiencia de reacción de acuerdo con las condiciones de los e...