Práctica 13 - Control microbiológico III (Efecto de los antibióticos) PDF

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Universidad Nacional Autónoma de México.Facultad de Estudios Superiores Zaragoza.Q uímica F armacéutica B iológica. M icrobiología G eneral I.“Control microbiológico III (Efecto de los antibióticos)”Grupo: 1652. Equipo: 1 Aguilar Flores Dilan Víctor.Efecto de los antibióticosDefinicionesAntibióticos...

Description

Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Estudios Superiores Zaragoza. Química Farmacéutica Biológica. Microbiología General I.

“Control microbiológico III (Efecto de los antibióticos)”

Grupo: 1652. Equipo: 1 Aguilar Flores Dilan Víctor.

Antibióticos. Son las sustancias químicas producidas por microorganismos y que poseen acción antibacteriana (actúan contra las bacterias).

Definiciones

Quimioterapéutico. Compuestos obtenidos por síntesis química y con características antibacterianas. Antimicrobiano. Incluye compuestos obtenidos a partir de microorganismos y los producidos por síntesis química, muchos antibióticos se pueden obtener por síntesis después de su caracterización.

Por su efecto antibacteriano

1. Bacteriostático. Impiden el desarrollo y multiplicación de las bacterias sin destruirlas, por lo que su efecto es reversible, cuando se retira el antibiótico. 2. Bactericidas. Su acción es total, produciendo la lisis bacteriana con efectos irreversibles. 1. De amplio espectro. Aquellos antibióticos que son activos sobre un número amplio de especies bacterianas.

Efecto de los antibióticos

Por su espectro

2. De espectro intermedio. Cuando tiene acción sobre un número limitado de especies. 3. De espectro reducido. Solamente son activos sobre un pequeño número de especies bacterianas.

Clasificación Por su estructura química

Esta clasificación se fundamenta en la estructura química que sirve como esqueleto del antibiótico, por ello la lista resulta ser algo larga:

Beta Lactámicos, Penicilinas, Nitrofuranos Nitroimidazoles, Cefalosporinas, Monobactámicos, Carbapenemos, Aminociclotioles, Aminoglicósidos, Anfenicoles, Glucopéptidos, Lincosamidas, Polipeptídicos, Quinolonas, Rifampicinas, Sulfunamidas, Tetraciclinas, Sinergistinas y Macrólidos

1. Impidiendo la síntesis de la pared bacteriana. Por su mecanismo de acción

2. Alterando la permeabilidad de la membrana citoplasmática. 3. Inhibiendo la síntesis proteica. 4. Bloqueando la síntesis de ácidos nucleicos. 5. Interfiriendo en las vías metabólicas.

1. Pruebas de difusión • El microorganismo aislado y puro que se va a estudiar, se siembra sobre la superficie de una placa de agar de Mueller-Hinton conociendo la concentración de bacterias que se siembra • Se aplican discos de papel filtro que contengan concentraciones diversas de los antibióticos a probar. • Tras la incubación de 24 horas se observan y se mide la zona de inhibición de crecimiento alrededor de cada disco. 2. Pruebas de dilución. Las pruebas de laboratorio de sensibilidad a los antibióticos se dividen en dos categorías:

Se puede conseguir una estimación más cuantitativa de la sensibilidad de una bacteria a un antibiótico realizando una prueba de Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) es decir, la concentración más baja que inhibirá in vitro el crecimiento de la bacteria a prueba. • •

Se preparan diluciones seriadas del antibiótico en caldo o en agar y se inoculan con una suspensión de bacterias aisladas Se incuban a 37 °C durante 24 horas, se registra la CIM como la dilución más alta a la cual no hay crecimiento microscópico.

Otra ventaja de una prueba de CIM es que puede extenderse para determinar la Concentración Letal Mínima (CLM), la cual es la concentración más baja de un antibiótico necesaria para matar a las bacterias. Para descubrir si e agente ha matado en realidad la bacteria en lugar de inhibirla, las diluciones de prueba se subcultivan en un medio adecuado sin el antibiótico, y se incuban de 18 a 24 horas. Se considera bactericida al antibiótico si la CLM es igual o menos de cuatro veces a CIM.

Pruebas a los antibióticos

Combinación de antibióticos

Los pacientes hospitalizados o ambulatorios, reciben con frecuencia más de un agente antibacteriano los cuales pueden interactuar entre sí y también con otros fármacos, como los diuréticos, las combinaciones de antibióticos pueden ser:

1. Sinérgicos: Si la actividad es mayor a la suma de las actividades individuales. 2. Antagónico: Si la actividad de un fármaco se ve reducida por la presencia de otro. 3. Aditivo: Si el efecto de ambos antibióticos combinados, es igual a la suma de los efectos individuales.

Diagrama de flujo

Sembrar masivamente una caja de agar Mueller-Hinton, con la cepa de E. coli.

Flamear las pinzas de disección y cerca del mechero tomar un multidisco para Gram negativos.

Realizar el mismo procedimiento para la cepa de S. aureus, utilizando el multidisco para Gram positivos.

Incubar las cajas a 37 ºC durante 24 horas.

Leer los resultados, midiendo los halos de inhibición e interpretar estos mediante las tablas de sensibilidad del inserto.

Cuestionario.

•

1. ¿Por qué se utiliza el agar Mueller-Hinton para la sensibilidad bacteriana de los antibióticos? Porque es un medio de cultivo no selectivo que promueve el desarrollo microbiano. Presenta buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad, su contenido e inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina es bajo, la mayoría de los patógenos microbianos crecen satisfactoriamente. 2. ¿Cuál es la importancia de determinar para una bacteria los parámetros de CIM y CLM? • La determinación de la Concentración Inhibidora Mínima (CIM) es la base de la medida de la sensibilidad de una bacteria a un determinado antibiótico. La CIM se define como la menor concentración de una gama de diluciones de antibiótico que provoca una inhibición de cualquier crecimiento bacteriano visible. Es el valor fundamental de referencia que permite establecer una escala de actividad del antibiótico frente a diferentes especies bacterianas. Hay diferentes técnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de rutina, y de manera semicuantitativa, las CIM (métodos manuales y métodos automatizados o semiautomatizados). Estos diferentes métodos de rutina permiten categorizar una cierta cepa bacteriana en función de su sensibilidad frente al antibiótico probado. Esta cepa se denomina Sensible (S), Intermedia (I) o Resistente (R) al antibiótico. Para un determinado antibiótico, una cepa bacteriana es, según la NCCLS: ➢ Sensible, si existe una buena probabilidad de éxito terapéutico en el caso de un tratamiento a la dosis habitual. ➢ Resistente, si la probabilidad de éxito terapéutico es nula o muy reducida. No es de esperar ningún efecto terapéutico sea cual fuere el tipo de tratamiento. ➢ Intermedia, cuando el éxito terapéutico es imprevisible. Se puede conseguir efecto terapéutico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o aumento de la posología). • Ciertas moléculas son representativas de un grupo de antibióticos. Los resultados (S, I, R) obtenidos con estas moléculas pueden ser ampliados a los antibióticos del grupo, que en ese caso no es necesario ensayar (Ejemplo: Equivalencia entre la cefalotina que se ensaya y las restantes cefalosporinas de 1ª generación que no es necesario probar, ya que el resultado puede deducirse del obtenido en la cefalotina). Este hecho permite ensayar un número reducido de antibióticos, sin limitar por ello las posibilidades terapéuticas. Concentración Letal Mínima (CLM), la cual es la concentración más baja de un antibiótico necesaria para matar a las bacterias. Para descubrir si el agente ha matado en realidad la bacteria en lugar de inhibirla, las diluciones de prueba se subcultivan en un medio adecuado sin el antibiótico, y se

incuban de 18 a 24 horas. Se considera bactericida al antibiótico si la CLM es igual o menos de cuatro veces a CIM. 3. Dibuje las estructuras químicas de: a) Betalactámicos

b) Eritromicina

c) Tetraciclina

4. Describa brevemente el mecanismo de acción de los antibióticos que inhiben la síntesis de la pared bacteriana y de algunos ejemplos. • Actúan a distintos niveles de la biosíntesis del peptidoglucano, capa esencial para la supervivencia de las bacterias, y el daño se produce por la pérdida de la rigidez de la célula bacteriana que puede causarle la muerte; por lo tanto, son considerados como agentes bactericidas. La síntesis del peptidoglucano se lleva a cabo en tres etapas y los distintos antimicrobianos pueden afectar cada una de ellas. Los representantes de este grupo son las penicilinas y cefalosporinas. • Ejemplos: Cefaloridina Vancomicina Penicilinas Cefalosporinas 5. Describa brevemente el mecanismo de acción de los antibióticos que alteran la permeabilidad de la membrana bacteriana y de algunos ejemplos. • Actúan como detergentes o tensioactivos catiónicos y provocan una grave alteración de la membrana celular, modificando la permeabilidad y permitiendo el escape de aminoácidos intracelulares, purinas, pirimidinas y otras moléculas fundamentales para la vida celular. Las polimixinas actúan de este modo, interactuando sobre los fosfolípidos de la membrana celular, mientras que la nistatina y la anfotericina B son activos frente a hongos, se unen a un grupo esterol de la membrana que solamente contienen los microorganismos contra los cuales se utilizan estos ATB. • Las bacterias más susceptibles son las que tienen en su membrana un mayor contenido de fosfolípidos (gramnegativas). La insensibilidad o resistencia está en relación con la impermeabilidad de la pared celular para estos fármacos, como el caso de las grampositivas que tienen una pared celular muy gruesa. • Ejemplos:

6. Describa la técnica de Kirby-Bauer. • Sobre la superficie de una placa de agar Müller-Hinton se inocula una cantidad estandarizada de bacterias, sembrándolas de forma uniforme para obtener después de la inoculación un "césped" bacteriano. • A continuación, se colocan discos de papel de filtro impregnados con concentraciones conocidas de los diferentes antibióticos (la elección de los antibióticos a probar depende del germen y del foco de infección). • Se incuba la placa durante 18-24 horas a 37 °C (respetar este parámetro, porque temperaturas menores pueden disminuir la velocidad del crecimiento del germen y la difusión del antibiótico, dando halos irregulares difíciles de medir). • Luego se miden los halos de inhibición de desarrollo, interpretándose de acuerdo a tablas confeccionadas previamente. • Los resultados se expresan como: Sensible (S), Intermedio o Moderadamente sensible (I) y Resistente (R). 7. Mencione el mecanismo de acción de los siguientes antibióticos I. Sulfonamidas. Las sulfamidas tienen un efecto bacteriostático. Su acción antibacteriana se debe al hecho de que funcionan como análogos estructurales del ácido paraaminobenzoico (PABA), inhibiendo competitivamente por el acceso a la enzima dihidropteroil-sintetasa. II. Ceftriaxona La ceftriaxona, como todos los antibióticos beta-lactámicos es bactericiday actúa inhibiendo la síntesis de la pared bacteriana al unirse específicamente a unas proteínas llamadas "proteínas ligandos de la penicilina (PBPs)" que se localizan en dicha pared. Las PBPs son responsables de varios de los pasos en la síntesis de la pared bacteriana y su número oscila entre varios cientos a varios miles de moléculas en cada bacteria. Estas proteínas son diferentes para cada especie bacteriana, por lo que la actividad de cada uno de los antibióticos beta-lactámicos depende de la capacidad de estos para acceder y unirse a dichas proteínas. III. Ácido nalidíxico Las quinolonas bloquean la ADN-girasa, uniéndose a la subunidad de tipo A. Recordemos que las bacterias poseen una clase especial de topoisomerasas de tipo II, llamadas girasas, que introducen superenrollamiento negativo en la doble hélice del ADN. La ADN-girasa está constituida por dos subunidades de tipo A y dos de tipo B (A2B2); las de tipo A producen los cortes y empalmes sucesivos en la doble cadena, mientras que las subunidades B son ATPasas que proporcionan la energía para la reacción. El bloqueo de las quinolonas sobre la girasa supone que ésta queda "congelada" en la fase en que el ADN está unido al enzima. Ello provoca la acumulación de roturas de doble cadena, lo que conduce a la muerte de la bacteria.

8. Mencione cómo adquieren algunas bacterias, de manera natural, resistencia a los antibióticos. • Proviene de mutaciones en su ADN o bien, originarse por transferencia de genes. El fenómeno de la mutación aparece espontáneamente con una frecuencia de 106 a 109, según el tipo de bacterias y las características ambientales. 9. Mencione cómo se manifiestan los mecanismos de drogo resistencia. • Inactivación enzimática de los antibióticos, como es el caso de las enzimas beta lactamasas. En este caso la enzima, elaborada por la bacteria, inactiva a la molécula de la droga volviéndola incapaz de actuar. Hay que tener presente que este mecanismo es el único capaz de inactivar a la molécula de antimicrobiano. • Impermeabilidad de la membrana o pared celular. Por ejemplo, modificaciones en las porinas, lo que repercutirá en resistencias de bajo nivel a diversos antimicrobianos. • Expulsión por mecanismos activos del antibiótico. Las resistencias a las tetraciclinas pueden se debidas a este tipo de mecanismos. • Modificación del sitio blanco del antibiótico en la bacteria. En algunos casos hay una reducción de la afinidad del receptor por la molécula de antimicrobiano. Una mutación de la girasa de ADN, por ejemplo, puede dar lugar a una menor afinidad de las quinolonas por la citada enzima. Otro ejemplo es el cambio de las enzimas involucradas en la síntesis de ácido paraaminobenzoico, lo que da lugar a resistencias a sulfas y trimetoprima, mecanismo que se suma al mencionado en primer lugar. 10. ¿Qué factores intervienen o modifican los resultados de un antibiograma? • Componentes del medio de cultivo • Concentración en cationes • Osmolaridad • pH del medio • Atmosfera de incubación • Densidad del inóculo • Temperatura de incubación • Tiempo de incubación

Extras •

Antibióticos generalidades

Los antibióticos actúan de tres formas fundamentales: • • •

Atacando la pared celular Atacando los ribosomas Atacando el Núcleo

Antibióticos que actúan inhibiendo la síntesis de pared celular. P E

Penicilina

C A

Cefalosporinas

Carbapenemas

M O

Monobactamas

S Antibióticos que actúan inhibiendo la síntesis de proteínas atacando los ribosomas. Cloranfenicol L I M A T

Linezolid

Lincosamidas

Actúan sobre la subunidad 50s

Macrólidos Tetraciclinas

E

Actúan sobre la subunidad 30s

A M

Aminoglucósidos

O Antibióticos que actúan inhibiendo la síntesis de ADN atacando al núcleo. Q U I

Quinolonas

Actúan inhibiendo la síntesis de la DNA-girasa

N Nitroimidazoles

O

Inhibe la síntesis de acidos nucleicos Altera la permeabilidad de la membrana

Lipopéptidos O N

Glucopéptidos

Inhibe la síntesis de pared celular (por una ruta diferente)

A Sulfonamidas Trimetropil •

Inhibe la síntesis de ácido fólico

Penicilinas

Son antibióticos inhibidores de la síntesis de pared celular (beta-lactámicos). Alexander Fleming descubrió la penicilina en un hongo por accidente después de la primera guerra mundial. La penicilina “G” sódica cristalina tenia 2 problemas, su aplicación era muy dolorosa y su tiempo de vida media era muy corto, por lo que se tenia que aplicar constantemente para conseguir el efecto terapéutico deseado. Para arreglar estos problemas se le agrego un anestésico local llamado procaína, pero esto no arreglo el problema del tiempo de vida media corto, por lo que se creo la penicilina G benzatínica, lo cual resolvió este último problema. Posteriormente se creo la penicilina V (fenoximetilpenicilina) que se podía administrar vía oral. El uso constante de estas penicilinas ocasiono que las bacterias generaran una defensa natural contra estas moléculas, sintetizando enzimas que les permitían romper el anillo betalactámico que las conforma (betalactamasas). Posteriormente, se crearon penicilinas betalactamasas-resistentes con el objetivo de que resistieran el ataque de las enzimas bacterianas que rompían su anillo. Después se les agrego un grupo amino el cual les dio el nombre de “aminopenicilinas” con el objetivo de aumentar su espectro de acción (ampicilina y amoxicilina), pero estas no eran resistentes a las betalactamasas. Se crearon también Antipseudomonas que se dividen en 2 grupos: • •

Ureidopenicilinas (Piperacilina) Carboxipenicilinas (Carbencilina)

Al igual que las amino penicilinas, estas ultimas tampoco eran resistentes a las betalactamasas y en respuesta a ello se crearon las penicilinas anti betalactamasas,

a los cuales se les agregó sulbactam sódico, ácido clavulánico y tazobactam que les sirvió como protección ante las betalactamasas.

Bibliografía •

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