Práctica 2.Actividad Ni R 2015-16 Guión Prácticas PDF

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Prácticas de Fisiología Vegetal, 2º Curso del Grado en Biotecnología DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD NITRITO REDUCTASA EN HOJAS DE ESPINACAS PARTE I ELABORACIÓN DE LA RECTA DE CALIBRADO PARA EL ANÁLISIS CUANTITATIVO DE NITRITO 1. Introducción La valoración de la concentración de un compuesto X en solución es una de las aplicaciones más comunes de la espectrofotometría. Cuando la solución es de un único compuesto, que posee un espectro de absorción característico, la determinación de su concentración se puede realizar mediante una sencilla lectura fotométrica. Sin embargo, frecuentemente la solución contiene otros productos que absorben luz a la misma longitud de onda que X y, por tanto, interfieren en su análisis, o bien el compuesto X no posee un máximo de absorción característico. En estos casos, se utilizan reactivos que al reaccionar con el compuesto X rinden de manera cuantitativa un nuevo producto que sí puede valorarse fácilmente. En esta práctica se construirá la recta de calibrado para el nitrito y se determinará la actividad nitrito reductasa (NiR) en un extracto problema. El análisis cuantitativo del anión nitrito es importante no sólo por tratarse de un contaminante ambiental, sino también porque este análisis es la base para la determinación de actividades fisiológicas tan importantes en el metabolismo del nitrógeno de las plantas vasculares como son las que catalizan las enzimas nitrato reductasa y nitrito reductasa. El nitrito, en medio ácido, reacciona con la sulfanilamida para producir una sal de diazonio, la cual reacciona a su vez con el dihidrocloruro de N-(1-naftil)etilendiamina (NNEDA), una amina aromática, para dar lugar a un compuesto de color fucsia de intensidad proporcional a la concentración de nitrito y que tiene un máximo de absorbancia a 540 nm (Figs.1 y 2).

Figura 1. Fundamento de la determinación de nitrito por el método de la sulfanilamida-NNEDA

Figura 2. Zona visible del espectro de absorción del producto coloreado formado en la reacción del nitrito con sulfanilamida-NNEDA

La absorbancia de una solución viene determinada por la ley de Lambert-Beer:

A = E

x

c

x

l donde:

A = Absorbancia E = Coeficiente de extinción (L mol-1 cm-1) c = Concentración del compuesto en la solución de la cubeta (mol L-1) l = Paso de luz (longitud en cm que la luz tiene que atravesar en la cubeta) Normalmente el valor del paso de luz es 1 cm. 2. Materiales - 1 pipeta automática de 1 ml

- 20 ml de sulfanilamida en un tubo Falcon

- 1 pipeta automática de 0,2 ml

- 20 ml de NNEDA en un tubo Falcon

- 1 pipeta automática de 0,02 ml

- rotulador

- Puntas de pipeta

- 5 ml de KNO2 100 M en un tubo de ensayo

- 14 tubos de ensayo en una gradilla

- 3 cubetas de espectrofotómetro

- 25 ml de agua destilada en un vaso de ppdo - 5 viales de centrifugación 3. Método 3.1. Preparación de las soluciones Se toman 8 tubos de ensayo, se rotulan del 1 al 8 y se añade en cada uno de ellos el volumen de solución de nitrito potásico (KNO2) 100 M indicado en la Tabla 1. Un noveno tubo se rotula con la letra B (0), que se usará como la referencia o blanco. Se añade agua destilada hasta completar un volumen total de 1 ml (ver Tabla 1). A continuación se añade 1 ml de sulfanilamida en cada tubo, se agita suavemente para homogeneizar las soluciones y se añade 1 ml de NNEDA. Se vuelve a agitar suavemente y se deja a temperatura ambiente durante 15

minutos para que se desarrolle completamente el color. Es fundamental que se añada siempre primero la sulfanilamida y después la NNEDA para que transcurra la reacción de diazonización y, por tanto, aparezca el color fucsia. Para la preparación del tubo de referencia o blanco, que se rotulará con una B, se procederá igual que con las anteriores soluciones sólo que en este caso no se añade nitrito (al no poseer nitrito la solución apenas desarrollará color) (Tabla 1). Las soluciones se preparan ordenadamente de menor a mayor concentración en los tubos de ensayo. Use cada punta de pipeta exclusivamente para cada reactivo. Las soluciones abajo indicadas ya están previamente preparadas. SULFANILAMIDA: -

200 ml de HCl comercial

-

10 g de sulfamilamida

-

agua hasta 1litro N-NEDA:

-

200 mg de dihidrocloruro de N-(1-naftil) etilendiamida

-

agua hasta 1 litro

3.2. Medidas espectrofotométricas Se selecciona en el espectrofotómetro la longitud de onda de 540 nm. A continuación se introduce en la cubeta de lectura la solución del tubo blanco (aquel que no contiene nitrito) y se calibra a cero la lectura del espectrofotómetro. Se lee la absorbancia a 540 nm del resto de los tubos usando la misma cubeta. Pasar las soluciones de los tubos de ensayo a la cubeta. Tras anotar la absorbancia de un tubo, se devuelve la solución medida a su correspondiente tubo de ensayo. Una vez vacía la cubeta, se elimina el resto de volumen golpeándola suavemente boca abajo contra un trozo de papel de filtro. Se procede de la misma manera para el resto de las soluciones. Las soluciones se leerán ordenadamente de menor a mayor concentración de nitrito, es decir, de menor intensidad de color a mayor intensidad. Es muy importante que esta última operación se realice ordenadamente.

4. Resultados TABLA 1

Protocolo para la construcción de la recta de calibrado de valoración de nitrito por el método de la sulfanilamida-NNEDA La penúltima columna indica la concentración final de nitrito en cada tubo REACTIVOS (ml) TUBO Nº KNO2 100 (M)

dH2O

Sulfanilamida

NNEDA

KNO2

A540

(ml)

(ml)

(ml)

Blanco

(ml) 0

1,0

1,0

1,0

(M) 0

0

1

0,06

0,94

1,0

1,0

2

0,110

2

0,12

0,88

1,0

1,0

4

0,195

3

0,18

0,82

1,0

1,0

6

0,316

4

0,24

0,76

1,0

1,0

8

0,420

5

0,3

0,7

1,0

1,0

10

0,515

6

0,36

0,64

1,0

1,0

12

0,634

7

0,48

0,52

1,0

1,0

16

0,797

8

0,6

0,4

1,0

1,0

20

0,980

5. Discusión 1) Represente gráficamente los datos de absorbancia obtenidos (eje de ordenadas) frente a la concentración de nitrito expresada en µM (eje de abscisas). [KNO2]μm A540

0 2 4 6 8 10 12 16 20

0 0,11 0,195 0,316 0,42 0,515 0,634 0,797 0,98

2) Halle el coeficiente de extinción molar (E) a partir del valor de la pendiente de la recta que se traza abarcando todos los puntos. La absorbancia de una solución viene determinada por la ecuación de Lambert-Beer: A=Ɛ x l x c Ɛ =Pendiente de la recta=0,09494 μM-1*cm-1 PARTE II ACTIVIDAD METILVIOLÓGENO- NITRITO REDUCTASA (MVH-NIR) La actividad nitrito reductsa (NiR) se mide colorimétricamente por desaparición de nitrito del medio de reacción utilizando como donador artificial de electrones metil viológeno (MV) reducido químicamente por Na2S2O4 (ditionito sódico). La reacción se lleva a cabo in vitro en extractos celulares de hojas de espinacas resuspendidas en un tampón Tris-HCl 500 mM (pH 8,0) en proporción 1/4 (p/v) (el extracto es suministrado). Se procede de la siguiente forma: 1. Preparar la mezcla de reacción que contiene (volumen de la mezcla de reacción 0,8 ml):

-

300 l de Tris-HCl 0,5M (pH 8,0) (150 moles),

-

20 l de KNO2 20 mM (0,4 moles),

-

100 l de MV 8 mM (0,8 moles), y -

380 l de agua.

2. Se añaden 100 l del extracto celular (EC) a la mezcla de reacción, se homogeneiza y se introduce en un bloque térmico a 37 ºC. Esperar 2-5 minutos a que se atempere a 37 ºC.

3. La reacción se inicia por adición de 100 l de Na2S2O4 disuelto en NaHCO3 0,29 M (26,7 mg/ml). El volumen total en el vial donde transcurre la reacción a 37 ºC: mezcla de reacción (0,8)+ extracto (0,1) + ditionito (0,1) = 1 ml.

a. Una vez añadido el ditionito se toma inmediatamente 100 l de la mezcla total y se ponen en un tubo de ensayo nuevo de vidrio (marcado como R0) donde la reacción se parará por agitación en vortex (oxidación del ditionito) hasta que la solución se vuelva incolora. Estos 100 l se tomarán como blanco de la reacción (tiempo cero). b. Incubar el resto de la mezcla de reacción a 37 ºC. c. Transcurridos 5 y 10 min de incubación, se toman 100 l de la mezcla total y se ponen en tubos de ensayo de vidrio nuevos (marcados como R5 y R10) donde la reacción se detiene por oxidación del Na2S2O4, agitando fuertemente en vortex.

4. Añadir a los tubos de ensayo R0, R5 y R10, que contienen los 100 l, 900 l de agua, 1000 l de sulfanilamida y 1000 l de N-NEDA, EN ESTE ORDEN (la reacción que ocurre es lo visto en la recta de calibrado, por tanto hay que tener en cuenta las mismas consideraciones). Se espera a que se desarrolle el color durante 15 min y se mide la absorbancia a 540 nm. TUBO Nº

Extracto(l)

H2O (l)

SULFA N-NEDA (ml) (ml) 1 1

A540

R0

100

900

R5

100

900

1

1

0,470

R10

100

900

1

1

0,344

0,594

Actividad NiR (nmol min-1mg Chl-1) 0 681,436 nmol/min*mgChl 693,86 nmol/min*mgChl

Discusión

1. Calcular la actividad de la enzima NiR de hojas de espinacas a los 5 y 10 min expresada como nmol min-1mg Chl-1, así como la actividad media obtenida a partir de estos dos valores. (Chl = clorofila)

PARTE III

DETERMINACIÓN DE CLOROFILA

El valor de la actividad nitrito reductasa (NiR) la expresamos en las siguientes unidades: nmol min-1mg clorofila-1. Para determinar la concentración de clorofila total (Chl) en nuestro extracto se procede así: Pipetear:

-

100 l del extracto de hojas de espinacas (EC) en un vial de centrifugación.

-

Añadirle 1100 l de acetona al 80% (v/v).

-

Agitarlo vigorosamente en el vortex.

-

Centrifugarlo 1 min a la máxima velocidad y recuperar el sobrenadante.

-

Medir la absorbancia del sobrenadante a 652 nm (hacer el blanco con acetona al 80% (v/v)).

El coeficiente de extinción de la clorofila expresado en ml mg Chl-1cm-1 es de 34,5.

Tabla 2 TUBO Nº

Extracto(l) Acetona (l) A652

B

0

1200

0

Conc. clorofila total (mg Chl ml-1) 0

EC

100

1100

0,332

0,115 mgChl/ml

Discusión 1. Calcular la concentración de clorofila total en mg Clorofila/ ml....