Práctica virtual #3 Mediciones de longitud en microscopia 2020 II Guía PDF

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Curso: Fundamentos de la Biología Celular Práctica de laboratorio virtual # 3: Mediciones de longitud en microscopia OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA  

Calcular la longitud de estructuras microscópicas utilizando el ocular micrométrico virtual. Utilizar la barra de escala (de referencia) para medir la longitud de estructuras en microfotografías.

INTRODUCCIÓN I. Mediciones usando ocular micrométrico. El diámetro de una célula o la longitud/diámetro de componentes subcelulares o la longitud de cualquier objeto pequeño pueden medirse usando un ocular micrométrico que tiene una graduación en unidades arbitrarias (Fig.1). Esta graduación arbitraria del ocular micrométrico se calibra usando una lámina patrón (Fig. 2) por superposición de ambas escalas. El ocular micrométrico ha sido colocado previamente dentro del tubo ocular, de modo que la escala graduada sea visible en el ocular al observar a través de él. Existen diversas formas de oculares micrométricos (Fig.3). En este tutorial usaremos un ocular simple (Fig. 1) Cada unidad o división de la lámina patrón mide 10 μm, y sabiendo cuántas divisiones del ocular micrométrico equivalen al sobreponerse con las divisiones de la lámina patrón (Fig. 4), se puede calcular el número de micrómetros (μm) en cada unidad del ocular micrométrico. También se puede determinar la longitud de cada división del ocular micrométrico (factor de calibración), dividiendo el largo observado de la lámina patrón por el número total de divisiones en la escala del ocular micrométrico. El factor de calibración se calcula por regla de tres simple de la siguiente manera: Por ejemplo, si a 100X, 20 divisiones del ocular micrométrico coinciden con 20 divisiones (20 x 10 µm = 200 µm) de la lámina patrón, entonces: 1 división del ocular micrométrico = 200 µm = 10 µm 20 divisiones Esta operación se puede repetir con cada lente objetivo (excepto el lente de inmersión). La figura 5 muestra la calibración del ocular micrométrico sobreponiéndolo con la lámina patrón a diferentes aumentos. Una vez calibrado el ocular micrométrico, se retira la lámina patrón y se coloca la lámina portaobjetos con la muestra a ser medida. En el ejemplo de la figura 6, la longitud de lo observado a 100X corresponde con 4 divisiones del ocular micrométrico. Si se calculó que cada división a 100X equivale a 10 µm, la longitud del grosor del pelo de la musaraña será 40 µm. Longitud del grosor del pelo = 4 divisiones x 10 µm = 40 µm. En este tutorial, vamos a asumir que el ocular micrométrico ya ha sido calibrado previamente y que cada unidad del ocular micrométrico tiene un valor especifico según el objetivo que se utilice (tabla 1). 1

Magnificación total 40X 100X 400X 1000X

Valor de la unidad del ocular micrométrico (μm) 25 10 2.5 1

Tabla 1. Valores de la unidad del ocular micrométrico según magnificación total.

Figura 1. Ocular micrométrico

Figura 2. Lámina patrón

Figura 3. Diferentes tipos de oculares micrométricos

Figura 4. Sobreponiendo el ocular micrométrico con la lámina patrón

Figura 5. Calibración del ocular micrométrico con la lámina patrón a diferentes aumentos.

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con ocular micrométrico: sección espatular de un pelo de guardia (de protección) de Cryptotis mayensis “Musaraña” 40µm (±2.31). Foto tomada de: Pech-Canché J. et al. (2009)

100X II. Mediciones usando barra de escala (barra de Si tiene el valor de R de una barra de referencia en una microfotografía, puede medir con una regla la longitud (cm o mm) de la barra de referencia y la longitud de cualquier estructura y compararlas mediante regla de tres simple directa. Por ejemplo, en la figura 7, la barra de referencia de 15 mm de longitud (L) representa 0.2 µm (R) y en la microfotografía usted mide con la regla la imagen de una partícula viral (X) de 4 mm de longitud ¿Cuál será la medida real de la partícula viral? Si L = 15 mm es equivalente a 0.2 µm (R) Entonces, X = 4 mm es equivalente a ? µm ? = 4 mm x 0.2 µm = 0.05 µm = 50 nm 15 mm La partícula viral (X) de la figura 7 tiene una longitud real de 50 nm de diámetro.

Barra de referencia dibujada L= 15mm

X= 4mm

0.2 µm

R

Figura 7. Vesícula de una célula epitelial infectada con coronavirus, llena de partículas virales. L = 15 mm = 1.5x104 µm. Foto M. Arana

En caso esté interesado en cómo hallar el valor de R de la barra de referencia (no es un objetivo del tutorial), en el anexo de este tutorial se explica el procedimiento. MATERIALES

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Microscopio compuesto de campo claro virtual (www1.udel.edu/biology/ketcham/mic roscope/scope.html.) Láminas preparadas para enfocar (punta de la raíz de cebolla, capsulas bacterianas, raspado bucal) proporcionadas en la simulación. Microscopio electrónico de barrido virtual (http://myscopeexplore.org/virtualSEM_explore.html)

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Microfotografías tomadas a partir de un microscopio electrónico de barrido y microscopio electrónico de transmisión.

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Figura 8. Componentes del microscopio óptico compuesto de campo claro virtual (Modificado de www1.udel.edu/biology/ketcham/microscope/scope.html.)

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Figura 9. Panel de las cuatro laminas preparadas para su observación en el simulador.

Figura 10. Lista de verificación de pasos realizados en la vista del microscopio y en la vista a través del microscopio. Cuando un paso ha sido verificado, su casilla se marcara con un check. Mientras un paso no haya sido realizado, su casilla correspondiente quedara en blanco.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Bregman, A. (1983). Laboratory Investigations in Cell Biology. John Wiley & Sons. New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore.  Pech-Canché J., Sosa-Escalante JE., Koyoc Cruz ME. (2009) Revista Mexicana de Mastozoología13:7-33. Enlaces internet:  Simulador de Microscopio Electrónico de Barrido (MEB): http://myscope-explore.org/virtualSEM_explore.html  Parry-Hill M., Fellers T.J, y Davidson M.W. - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310. Nikon microscopy U. Tutorial interactivo para la medición con ocular micrométrico(2000-2015). http://www.microscopyu.com/tutorials/java/reticlecalibration/index.html 

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Ficha de trabajo Tutorial interactivo # 3: Microscopia. Mediciones con el microscopio compuesto de campo claro: Longitud Recomendaciones técnicas antes de utilizar el simulador: Si utiliza una PC o laptop, descargue el programa Adobe Flash Player, link aquí: https://get.adobe.com/es/flashplayer/. Una vez instalado Flash Player, actívelo en su navegador. Para ello recomendamos utilizar: Google Chrome, Mozilla Firefox o Safari. Si va a utilizar un celular, es recomendable que descargue el buscador Puffin Browser.

Una vez instalado, ingrese la dirección URL del simulador de microscopio: http://www1.udel.edu/biology/ketcham/microscope/scope.html. A continuación, haga clic sobre los tres puntos que se encuentran al costado derecho de la dirección URL y active la opción “ratón” que se muestra en entre las opciones. Elija la opción “puntero de ratón”.

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El cursor negro del ratón ahora le va a permitir manipular las opciones del simulador de microscopio compuesto. Utilizando el navegador de su elección y dependiendo de la herramienta (laptop o celular) escogida para el trabajo de hoy, ingrese a la dirección URL de la Universidad de Delaware: www1.udel.edu/biology/ketcham/microscope/scope.html.

Objetivo 1: Calcular la longitud de estructuras microscópicas utilizando el ocular micrométrico virtual 1. Familiarícese nuevamente con su microscopio compuesto de campo claro virtual identificando sus componentes (figura 8). 2. Encienda su microscopio haciendo clic izquierdo en el botón ON y rotando la perilla de la intensidad de la luz hacia el 10. Ahora, observara que la lámpara luminosa se enciende. 3. Haga clic izquierdo en el botón “Switch views” para cambiar a una vista desde el microscopio y regule la distancia interpupilar, arrastrando con el cursor del mouse el tubo ocular derecho, hasta que aparezca solo un campo de visión. Observe que, además, aparece una pequeña regla en el centro del campo de visión llamada: ocular micrométrico. 4. Haga clic izquierdo sobre el botón “switch views” nuevamente, para tener una vista panorámica del microscopio. A continuación, vamos a colocar una lámina de una muestra coloreada de un raspado bucal (figura 9). Haga clic izquierdo en dicha lámina y esta se colocara en la platina, debidamente ajustada por la pinza. 5. Haga clic izquierdo en “Check list” ubicado en la parte superior izquierda de su microscopio y observara que aparece una lista de verificación, dividida en una lista de verificación de lo visto en el microscopio y otra de lo visto a través del microscopio (figura 10). Cada vez que un paso sea realizado correctamente se marcara como un ‘check’ en la lista de verificación. Cuando su muestra este correctamente centrada se marcara la casilla ‘muestra centrada’ en la lista de verificación de lo visto en el microscopio. Utilizar esta lista de verificación, puede ayudarnos a lograr enfocar correctamente una muestra a distintos aumentos de objetivo. 6. Centre la muestra utilizando las perillas de control de ejes de coordenadas (figura 8) y observe que en la lista de verificación se marca la casilla de espécimen centrado. 9

7. Empecemos con el enfoque grueso, moviendo la perilla macrométrica hasta que se marque la casilla de “iniciar platina en la posición superior”. Haga clic izquierdo en “Switch views” para tener una vista desde el microscopio y retroceda el macrométrico para mejorar el enfoque. Para el enfoque fino, mueva el tornillo micrométrico hasta que la casilla de “enfoque fino” se marque en la lista de verificación. Para saber que hemos logrado enfocar bien, aparecerá un círculo rojo sobre la muestra. Finalmente centre la muestra y verifique que se marcó la casilla de “imagen centrada”. 8. Observe las células a 40X, 100X y 400X de aumento total. Recuerde que necesitará incrementar la intensidad de la luz a medida que incrementa la magnificación de los lentes objetivos. Para ello, deberá mover la palanca del diafragma con el cursor del mouse. Para saber que la palanca del diafragma se encuentra en la posición correcta, verifique en la lista de tareas que la casilla “ajuste del diafragma” está marcado. 9. Haga clic izquierdo en el botón “switch views” y arrastre hacia la izquierda el revólver, utilizando el puntero del mouse, hasta que el objetivo de 10X quede sobre la muestra. Vuelva a cambiar la vista hacia el microscopio para ver el campo de visión y centre la muestra. Ahora observara el conjunto de células aumentado 100 veces. Repita los pasos para observar la muestra a 400X. No olvide regular la palanca del diafragma para obtener la luminosidad más adecuada, verificando que se marque la casilla “ajuste del diafragma”. 10. Observe la forma de las células. Con el ocular micrométrico, mida el diámetro de 02 células epiteliales a 400X y calcule el promedio. Para ello, asuma que cada espacio pequeño del ocular micrométrico (unidad del ocular micrométrico) mide 2.5 μm (tabla 1). Anote el promedio en la tabla 2. 11. Ahora vamos a cambiar a una muestra de origen vegetal, células de la raíz de cebolla. Para ello, haga clic izquierdo en “switch views” y desplace el revólver hasta el lente de 4X. Baje la platina con el tornillo macrométrico y haga clic izquierdo sobre la muestra de células de la raíz de cebolla (figura 9). 12. Repita los pasos anteriores para lograr el enfoque de la muestra de células de la raíz de cebolla. Observe las células a 40X, 100X y 400X. 13.

Observe la forma de las células. Con el ocular micrométrico, mida la longitud de 02 células a 400X y calcule el promedio. Anote el promedio en la tabla 2. 14. Finalmente, cambie a la muestra coloreada de bacterias encapsuladas. Observe las células a 40X, 100X, 400X y 1000X. 15. Con el ocular micrométrico, mida la longitud de 02 células bacterianas a 1000X y calcule el promedio. Anote el promedio en la tabla 2. Tabla 2. Longitud promedio de las células observadas.

Bacteria (Procarionte)

Epitelial (animal)

Células de cebolla (vegetal)

Promedio longitud (μm) Con respecto al tamaño de las células ¿A qué conclusiones puede llegar a partir de los resultados de la tabla 2?

Analizando la Tabla 1. ¿Qué relación encuentra entre el valor de la unidad del ocular micrométrico y el aumento total? 10

Objetivo 2. Utilizar la barra de referencia (de escala) para medir la longitud en microfotografías generadas por microscopio electrónico. 1. Ingrese a la dirección URL: http://myscope-explore.org/virtualSEM_explore.html. Esta dirección corresponde al Simulador Virtual de Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) de Thermo Fisher Scientific. 2. Primero vamos a seleccionar la muestra, para ello lleve el puntero del mouse hasta “Arthropods” y seleccione “Insect egg” (huevo de polilla). Haga clic izquierdo sobre la muestra. 3. A continuación, el aire llenara el microscopio para que la muestra pueda ser cargada. Seguidamente, haga clic en el botón “Evacuate”. Esto ayudará a que el aire sea sacado para crear vacío en el depósito de la muestra. Este es el primer paso que se debe hacer luego de colocar la muestra. 4. Ahora, seleccione el voltaje de aceleración del haz de electrones. Escoja la opción de 20kV (kilo voltios). 5. Seleccione ahora el tamaño del espacio “spot size” a través del haz de electrones en la superficie de la muestra. Escoja 10 nm. 6. Movamos la altura de la muestra dentro de la cámara, seleccionando 10 mm en la opción “z height distance”. 7. Vamos a encender el haz de electrones, seleccionando el botón HV ON (high voltaje). Observe como el haz de electrones se mueve barriendo la superficie de la muestra. 8. Existen 04 botones que pueden manipularse para obtener imágenes de mayor aumento. Estos botones son: Brillo, contraste, enfoque y magnificación. Ajuste únicamente el enfoque para generar una imagen más resuelta de los huevos de polilla. 9. Haga clic izquierdo en el botón “Save”, para que se genere la imagen final. La imagen será descargada a la computadora en formato .png. Observe la imagen y note la presencia de una barra de color blanco (barra de referencia) con un tamaño referencial de 100 μm. La siguiente figura (foto #1) corresponde a la microfotografía de los huevos de polilla generados por microscopio electrónico de barrido (MEB). Aplicando regla de tres simple directa, calcule el diámetro (d) aproximado del huevo de polilla (en μm) utilizando la barra de referencia.

Foto #1. Huevos de polilla (Fuente: http://myscope-explore.org/virtualSEM_explore.html)

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La siguiente figura (foto #2) corresponde a una microfotografía de la pulga del gato (Ctenocephalides felis) atrapada en el momento que mordía a un ser humano. Esta imagen ha sido generada por microscopio electrónico de barrido (MEB). Aplicando regla de tres simple directa, calcule el diámetro (d) aproximado de la pulga (largo en μm) utilizando la barra de referencia.

Foto #2. Pulga de gato “Ctenocephalides felis” (Fuente: http://myscope-explore.org/virtualSEM_explore.html)

Diámetro del huevo de polilla (foto #1)

Diámetro (largo) de la pulga del gato (foto #2)

¿Cuál de las dos estructuras medidas en las microfotografías (foto #1 y foto #2) bajo microscopio electrónico de barrido es más grande?

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Foto#3. Microfotografía bajo microscopio electrónico de transmisión (MET) de la bacteria Escherichia coli.

Foto #4. Microfotografía bajo microscopio electrónico de transmisión (MET) de una célula animal.

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Calcule el diámetro de ambos tipos de células (foto #3 y foto #4) e indique. ¿Cuál de las dos tipos de células medidas en las microfotografías bajo microscopio electrónico de transmisión es más grande?

ANEXO ¿Cómo se calcula el valor R de la barra de referencia de una microfotografía? Si conocemos la ampliación total de la imagen en una microfotografía (ampliación en el microscopio multiplicado por la ampliación de la fotografía) podemos construir una barra que indica la escala de la misma (barra de referencia) con la cual se puede calcular el tamaño real de las estructuras de la imagen, de manera similar a las barras de escala que observamos en los mapas. Para construir la barra de referencia se dibuja una línea en la microfotografía y se mide su longitud (L) con una regla. La medida en cm o mm debe convertirse a micras (µm) o nanómetros (nm). La equivalencia de la barra de referencia (R) se calcula aplicando la fórmula: 1) R= L MxF L = Medida de la longitud de la barra dibujada en la microfotografía, convertida en µm o nm. M = Ampliación de la imagen en el microscopio F = Ampliación de la imagen en la fotografía. Esto significa que la longitud R (en µm o nm) está representada en su microfotografía por la longitud L (en cm o mm). Cuando se trata de una microfotografía electrónica de barrido, es necesario usar un factor de corrección (B) en la fórmula: 2) R= L MxFxB

Veamos como ejemplo la microfotografía de la figura 7 que fue tomada al microscopio electrónico a 50000X (M) y la ampliación de la fotografía (F) fue de 1.5X. Con ayuda de una regla se dibuja una barra de referencia de 1.5 cm (15 mm = 1.5x104 µm) de longitud (L). 14

X= 4mm

Barra de referencia dibujada L= 15mm

0.2 µm

R

Figura 7. Vesícula de una célula epitelial infectada con coronavirus, llena de partículas virales. M = 50000X F = 1.5X L = 15 mm = 1.5 x 104μm. Foto: M.Arana Para calcular la equivalencia de la barra (R), reemplazamos en la fórmula 1) los valores de L y amplificación de la fotografía (M y F): 1.5x104 µm = 0.2 µm 50000 x 1.5 Una vez que tenga el valor de R de su barra de referencia puede medir con una regla la longitud en cm o mm de cualquier estructura y compararla, mediante regla de tres simple directa, con la barra de referencia. En el ejemplo de la figura 7, la medida real de la partícula viral marcada con la X es 50 nm.

R=

15...