Problemas puntuables BLOQUE 1 Resueltos- ---- PDF

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TEMA 7 1.

La bacteria Pseudomonas sp. ADP utiliza el herbicida atrazina como fuente de nitrógeno, pero sólo lo consume cuando no hay en el medio una fuente de nitrógeno preferencial, como el amonio, el nitrato, el nitrito o la glutamina. Esto es debido a que estas fuentes de nitrógeno provocan un aumento de la concentración intracelular de glutamina, que actúa como correpresor de los genes de la ruta. Hemos obtenido mutantes de pérdida de función en varios genes implicados en la asimilación de distintas fuentes de nitrógeno y queremos estudiar el efecto de estas mutaciones sobre la utilización de atrazina. Rellena la tabla indicando si cada mutante usará atrazina como fuente de nitrógeno en presencia de la fuente de nitrógeno indicada.

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Mutante glutamina sintetasa: esta enzima en la mayoría de los organismos es esencial para la formación de glutamina y por tanto esencial para la asimilación del amonio (ruta GS-GOGAT). Sin esta enzima en presencia tanto de amonio como de nitrato o nitrito se activaría la ruta de la atrazina. En presencia de glutamina podrían crecer, por lo que la ruta de la atrazina se encontraría desactivada.

Mutante transportador de amonio: En este caso no entra amonio en la célula, pero sí pueden entrar otras formas de nitrógeno, por lo tanto, en presencia de amonio no crece, pero en el resto sí. Se activa la ruta de la atrazana en presencia de amonio y en ausencia de cualquier fuente de nitrógeno alternativa a la atrazina. [esto en el caso de que el transportador de amonio solo actúe introduciendo amonio en la célula y no transportándolo por la misma una vez formado] no

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Mutante nitrato reductasa asimilatoria: en este caso no es posible la asimilación del nitrato, pues éste es necesario transformarlo en nitrito a través de la nitrato reductasa, y el nitrito será reducido a amonio gracias a la nitrito reductasa. Por tanto, en presencia de amonio sí crece, en presencia de nitrito y de glutamina también, pero no en presencia de nitrato. La ruta de la atrazina se activa en presencia de nitrato y en ausencia de todos. Mutante nitrito reductasa: está bloqueado un paso por el que tiene que pasar tanto el nitrato como el nitrito, por lo que no crece en presencia de ninguno. La ruta de la atrazina está activada en presencia de nitrato, nitrito y en ausencia de todos. Mutante transportador de nitrito: no crece en presencia de nitrito pero en los demás sí. La ruta se activa en presencia de nitrito y en ausencia de todos.

2.

La cianobacteria Anabaena variabilis presenta unas células especializadas denominadas heterocistos que, mediante una gruesa pared, consiguen impedir la entrada de oxígeno. ¿Qué función especializada cumplen estas células? ¿Cómo se hace dicha función compatible con el hecho de que los heterocistos presentan clorofila y obtienen energía mediante fotosíntesis? Las cianobacterias son bacterias fotosintéticas oxigénicas. Muchas cianobacterias son capaces de fijar nitrógeno, y algunas de ellas lo hacen dentro de heterocistos, células diferenciadas rodeadas de una gruesa pared que aíslan a la nitrogenasa del oxígeno, ya que la nitrogenasa es una enzima enormemente sensible al oxígeno. De esta forma, el heterocisto es impermeable al oxígeno, pero no al nitrógeno. El heterocisto sólo tiene fotosistema I, en donde está presente la clorofila, lo que le permite fabricar ATP mediante fotofosforilación cíclica, pero no produce oxígeno, ni NADPH, lo que le impide fijar CO2 . En este entorno anaerobio se sintetiza la nitrogenasa y se da la fijación del nitrógeno. El ATP que se produce es utilizado por la nitrogenasa para la reducción del N2 a amonio. El heterocisto tiene además actividad glutamina sintetasa, que le permite asimilar el amonio obtenido y producir glutamina. La glutamina es transportada a las células vegetativas como fuente de nitrógeno. La célula vegetativa tiene el aparato fotosintético completo, lo que le permite obtener energía y NADPH y fijar CO2. Los carbohidratos obtenidos de la fijación de CO2 (fotosintatos) son transportados al heterocisto, que los oxida para obtener (vía piruvato) los electrones necesarios para la fijación del nitrógeno.

3.

Azotobacter vinelandii es una bacteria fijadora de nitrógeno en vida libre aerobia estricta. Hemos aislado un mutante de A. vinelandii que presenta una cantidad de citocromo oxidasa diez veces menor que la estirpe silvestre. Este mutante es capaz de crecer en un medio con sacarosa como fuente de carbono y energía y amonio como fuente de nitrógeno con una tasa de crecimiento similar a la estirpe silvestre. Sin embargo, no es capaz de crecer con N2 como fuente de nitrógeno, a pesar de que sintetiza todas las proteínas necesarias para la fijación del nitrógeno. ¿A qué crees que puede deberse este fenómeno?

Por lo general, Azotobacter vinelandii fija cualquier forma de nitrógeno. Cuando la estirpe silvestre fija nitrógeno molecular, lo hace mediante protección respiratoria, consumiendo el oxígeno muy rápidamente para que no entre en contacto con la nitrogenasa. Como la estirpe mutante puede crecer con amonio y no con nitrógeno molecular, significa que sólo puede llevar a cabo la ruta GS-GOGAT. La ruta de fijación del N 2 se ve interrumpida cuando la nitrogenasa entra en contacto con el oxigeno y se degrada. El hecho de que entre en contacto con el oxigeno se debe a que los genes que codifican para la citocromo oxidasa están mutados, obteniéndose un rendimiento energético menor durante la respiración: el oxigeno se consumirá más lentamente, de forma que le dará tiempo de destruir a la nitrogenasa. 4. Un mutante de la bacteria Cucufata maxima carente de actividad glutamina sintetasa es capaz de utilizar amonio como fuente de nitrógeno vía glutamato deshidrogenasa siempre que el amonio se proporcione a alta concentración. Sin embargo, es incapaz de crecer en medio mínimo con amonio como única fuente de nitrógeno. ¿Por qué? Que carezca de GS quiere decir que no puede llevar a cabo la reacción de obtener glutamina a partir de glutamato y de amonio gastando 1 ATP. Por lo tanto, como dice el enunciado, el mutante es capaz de usar el amonio como fuente de nitrógeno por medio de la glutamato deshidrogenasa siempre y cuando sea un medio rico y con alta concentración de amonio (porque así esta enzima podría llevar a cabo su reacción teniendo disponibles todos sus precursores en dicho medio). Sin embargo no puede hacerlo en un medio mínimo aunque el amonio también esté en alta concentración. Esto se explica porque sabemos que el mutante es auxótrofo para la glutamina y por lo tanto en medio rico le da igual porque la glutamina ya va en el medio. Por otra parte, suponiendo que no hubiese glutamina en el medio, aún así habría una alta concentración de amonio, que le permite llevar a cabo la reacción en sentido de la síntesis de glutamina, a partir de la glutamato deshidrogenasa. En medio mínimo, sin embargo, la concentración de amonio es muy baja, y la reacción de la glutamato deshidrogenasa avanza en sentido de la desaminación de glutamina, y no de la formación de la misma, con la consiguiente fijación de amonio. Esto se debe a que la enzima tiene una baja afinidad por el amonio. 

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Cuando utilizamos como fuente de nitrógeno amonio la bacteria no precisa de la actividad nitrato reductasa para asimilarlo, ya que ya se encuentra en su forma más reducida. Cuando añadimos al medio amonio y nitrato, en condiciones de aerobiosis la bacteria realiza respiración aeróbica, por lo que no utiliza el nitrato como aceptor de electrones, y tampoco lo utiliza como fuente de nitrógeno ya que como en el caso anterior tiene una fuente de nitrógeno más económica como es el amonio. En cambio en condiciones de anaerobiosis, con amonio y nitrato como fuentes de nitrógeno, la bacteria utiliza el amonio como fuente de nitrógeno y el nitrato como aceptor de electrones, ya que no tiene oxígeno, por eso se detecta actividad nitrato reductasa en la membrana, pero no en el citoplasma. (Existen dos nitrato reductasas diferentes, una citoplásmica, encargada de la fijación de nitrógeno, y otra localizada en la membrana, que interviene en la cadena respiratoria). Cuando privamos a la bacteria de amonio como fuente de nitrógeno y tan solo tiene nitrato, si la bacteria se encuentra en aerobiosis utiliza el oxígeno como aceptor de electrones, y el nitrato para fijar nitrógeno, por ello se detecta actividad nitrato

reductasa citoplasmática, en cambio en anaerobiosis la bacteria precisa del nitrato tanto como fuente de nitrógeno como para utilizarlo como aceptor de electrones, es por ello que se detecta actividad nitrato reductasa tanto en el citoplasma como en la membrana. 6. El gen dctA de Rhizobium meliloti codifica un transportador de ácidos dicarboxílicos. ¿Cómo afectaría una mutación de pérdida de función en este gen a la fijación simbiótica de nitrógeno? En la fijación de nitrógeno molecular mediante la simbiosis entre leguminosas y Rhizobium se requiere de mucha energía en forma de ATP el cual se sintetiza mediante una respiración aeróbica, controlado por leghemoglobina, que necesita de poder reductor de compuestos orgánicos como el NADH o succinato. Entonces se requiere de un ciclo de ácidos tricarboxílicos oxidativo cuyos intermediarios son otorgados por la planta simbionte que además también son necesarios para la biomasa celular y la fijación del propio nitrógeno. Si en este bacteriode no funcionan o no poseen los transportadores necesarios para transportar ácidos orgánicos a su interior entonces no se daría lugar la fijación de nitrógeno y entonces tampoco existiría simbiosis por ninguna de los dos partes. TEMA 8 1.

Hemos obtenido un mutante de E. coli que es auxótrofo de cisteína, y sin embargo crece en ausencia de cisteína si se añade al medio alguna sal de sulfuro. ¿En qué paso(s) de la ruta de biosíntesis de cisteína podría estar bloqueado este mutante?¿Crees que es necesario añadirle algún otro aminoácido para que crezca en medio mínimo que no contenga sulfuro?

Auxótrofo de cisteína: debe haber cisteína en el medio para que la incorpore. Es incapaz de sintetizarla. Sal de sulfuro  crece sin cisteína. Este mutante estaría bloqueado en el paso que permite la reducción del sulfato a sulfito, o de sulfito a sulfato mediante el paso por APS y PAPS. De esta manera, cuando no le añadimos azufre reducido (sulfuro), el mutante es incapaz de sintetizarlo y por tanto, de convertir la O-acetilserina en cisteína por medio de la O-acetilserina sulfhidrilasa. Al añadirle la forma reducida, la enzima ya puede llevar a cabo la conversión hasta cisteína. Si al medio mínimo añadimos serina, a partir de ésta se podrá sintetizar tanto glicina como cisteína. 2.

Estamos estudiando los mecanismos de resistencia a penicilina de E. coli. Para ello, hemos tratado una estirpe de E. coli protótrofa y sensible a penicilina con nitrosoguanidina, un agente que introduce mutaciones puntuales en el ADN. Tras eliminar el mutágeno, inoculamos las células mutagenizadas en medio mínimo líquido e incubamos a 37ºC con agitación. Cuando el cultivo alcanza la fase exponencial, añadimos penicilina e incubamos 3 horas en presencia del antibiótico. Al término del tratamiento, lavamos las células y sembramos en medio rico LB sin el antibiótico. Entre los supervivientes, analizamos los fenotipos obtenidos, obteniendo dos grupos de mutantes: Grupo 1. Representa el 99% de los supervivientes, que son: • Sensibles a penicilina (no crecen si los sembramos en placas de LB con penicilina o si los inoculamos en medio LB líquido con penicilina) • Auxótrofos (no crecen si los sembramos en placas de medio mínimo sin suplementar con factores de crecimiento) • La auxotrofía es específica de cada mutante (distintos mutantes requieren la adición de distintos factores de crecimiento para poder crecer en medio mínimo) Grupo 2. Representa al 1% de los supervivientes, que son: • Resistentes a penicilina (crecen si los sembramos en placas de LB con penicilina o si los inoculamos en medio LB líquido con penicilina) • Protótrofos (crecen si los sembramos en placas de medio mínimo sin suplementar con factores de crecimiento) • Algunos de los mutantes de este grupo presentan mayor sensibilidad a stress osmótico que la estirpe silvestre Responde brevemente a las siguientes cuestiones: a) ¿Por qué aparecen mutantes del grupo 1 en nuestra selección? b) ¿Por qué representan la mayoría de los mutantes obtenidos? c) ¿Crees que obtendríamos los mismos resultados si en vez de penicilina hubiéramos usado lisozima como agente selectivo? d) ¿Qué proteína(s) crees que pueden tener afectada(s) los mutantes del grupo 2? a)Aparecen mutantes auxótrofos y sensibles a penicilina a pesar de haber estado incubados con el antibiótico durante tres horas porque la penicilina solo afecta a la pared de bacterias en crecimiento. En este caso, las bacterias debido a la mutagénesis no

pueden sintetizar por si solas todas las biomoléculas necesarias para crecer, por lo que al sembrarlas en medio mínimo no crecerían y por tanto no entrarían en fase exponencial; aunque no llegan a morir a pesar de la escasez de nutrientes ,debido a que no se incuban mucho tiempo en este medio. b)Porque hay más genes implicados en la síntesis de biomoléculas y por tanto en el crecimiento (por ejemplo: mutación en síntesis de alanina o lisina) que genes implicados en la resistencia a penicilina. Por lo tanto, habrá más posibilidades de que la mutagénesis haga mutantes auxótrofos que resistentes a penicilina. c)No, ya que las lisozimas catalizan la hidrólisis de los enlaces beta 1,4 entre los residuos de ácido N-acetilmurámico y N-acetil-Dglucosamina. Es decir, actúan sobre paredes bacterianas ya formadas. Por lo tanto, todas los mutantes quedarían sin pared. Si las células no se encuentran en medios no isotónicos al no tener pared estas morirán y no encontraremos células de ningún tipo. No habría células vivas y sensibles a penicilina, porque a pesar de encontrarse en fase estacionaria habrían muerto. d)Las PBPs (proteínas de unión a la penicilina). La mutación en estas proteínas explica el fenotipo de las células del grupo 2. Estas son protótrofas, no tienen mutado ningún gen relacionado con la síntesis de compuestos necesario para vivir. Resistentes a la penicilina ya que la mutación en estas proteínas disminuyen la afinidad de la PBPs por la penicilina. Mayor sensibilidad a los cambios osmóticos que las silvestres, porque al presentar mutada la PBPs dicha mutación no solo afectará a su unión con la penicilina sino que también puede afectar al correcto desarrollo de su función celular: la transglicosilación (inhibido por la vancomicina) y la transpeptidación, paso final de la síntesis del peptidoglicano. Es decir, pueden surgir fallos a la hora de sintetizar el peptidoglicano siendo la pared bacteriana más débil y siendo por tanto, la célula más inestable frente a los cambios de osmolaridad. 3. La inventomicina es un antibiótico que inhibe la síntesis de pared celular. Aunque aún no se conoce a ciencia cierta su mecanismo de acción, datos preliminares sugieren que es un inhibidor de la síntesis de bactoprenol. Hemos cultivado una 14

estirpe sensible a inventomicina con N-acetilglucosamina marcada con C en presencia y en ausencia del antibiótico en medio osmoestabilizado para impedir la lisis. En ausencia de inventomicina, la mayor parte de la marca radiactiva se encontraba asociada al peptidoglicano. En presencia del antibiótico, la mayor parte de la marca se localizaba en el citoplasma, en moléculas de N-acetil glucosamina-UDP o N-acetil murámico-UDP unido a un número variable de aminoácidos. ¿Apoyan estos resultados la hipótesis de que la inventomicina inhibe la síntesis de bactoprenol? Sí, ya que el bactoprenol es la molécula encargada de transportar las moléculas de NAM y NAG desde el citoplasma hasta el lado externo de la membrana, para que se dé lugar la síntesis del peptidoglicano. En ausencia de inventomicina el peptidoglicano puede sintetizarse correctamente por lo que el NAG marcado irá a formar parte del peptidoglicano de la pared celular. Sin embargo, en presencia del antibiótico, si éste afecta a la síntesis de bactoprenol, no podrán unirse ni transportarse el NAM y NAG ya que no son moléculas hidrofóbicas, quedando las moléculas de NAG-UDP y NAM-UDP en el citoplasma, unidas a aminoácidos. Aunque se haya marcado el NAG, también aparecerá NAM marcado ya que se fabrica a partir del NAG  ¿seguro? SI 4.

Un mutante frdA de E. coli carece de fumarato reductasa y no crece en medio mínimo en anaerobiosis, ya que no es capaz de sintetizar succinil-CoA, que es necesario para la síntesis de metionina, lisina y hemo. En presencia de succinato, el mutante crece normalmente en medio mínimo sin suplementar, ya que el succinato se convierte en succinil-CoA. Sin embargo, si añadimos al medio mínimo succinato marcado con 14C, la marca radiactiva aparece asociada al hemo, pero no a los dos aminoácidos indicados. A qué se puede deber esta observación? El succinil –CoA es una molécula que se origina en la ruta de los ácidos tricarboxílicos, donde una de las enzimas que participan es la fumarato reductasa, sin la cual no se biosintetizan ni la metionina, la lisina y el grupo hemo. El succinil-CoA se transforma a succinato y este a oxalacetato, por lo que si se suplementa con succinato no habrá ningún problema en la síntesis de la metionina y la lisina. El succinil-CoA no es más que un activador aunque es vital para la síntesis de metionina y lisina, ya que su función en estas rutas es activadora. De manera que se incorpora al succinil-CoA en la molécula, y luego este se pierde obteniendo energía de hidrólisis de un enlace de alta energía necesaria para completar la síntesis. Así es que se pierde la molécula por su papel activador en la ruta y, a pesar de estar marcada con 14C, solo aparece asociada al hemo. NO LO ENTIENDO

5. La fernicidina es un pigmento rojo con propiedades antibióticas producido por la bacteria Streptomyces fernandicus a partir de la ruta de biosíntesis de aminoácidos aromáticos. Estudiando la ruta de biosíntesis de fernicidina hemos obtenido una serie de mutantes no pigmentados que son incapaces de fabricar el antibiótico. Hemos realizado estudios de crecimiento de algunos de estos mutantes, obteniendo los siguientes resultados:

Asumiendo la ruta de biosíntesis de aminoácidos aromáticos de la figura 17 del Tema 8, responde a las siguiente preguntas: ¿En qué sección de la ruta de biosíntesis de fernicidina está afectado cada mutante? ¿Cuál es el último intermediario común de esta ruta con la de biosíntesis de fernicidina que nos permite identificar este experimento? ¿Cambiaría esta última respuesta si te dijera que los mutantes M1, M2 y M3 son rojos en los medios indicados en la tabla en los que crecen, mientras que el mutante M4 no está coloreado en ninguno de ellos?

- m1-> ruta tyr - m2-> ruta tyr+phe - m3-> chorismato, ruta aro - m4-> silvestre, no está mutado en ninguna parte de la ruta - el chorismato 6.

Indica dos diferencias fundamentales que hacen que la ruta de biosíntesis de ácidos grasos no sea la inversa de la β-oxidación Cuando se descubrió que la oxidación de los ácidos grasos transcurría mediante la eliminación oxidativa sucesiva de unidades de dos carbonos (acetilCoA), se pensó que la biosíntesis de ácidos grasos tendría lugar mediante la inversión de los mismos pasos enzimáticos. Sin embargo, la biosíntesis y degradación de los ácidos grasos transcurren por vías diferentes, están catalizadas por enzimas distintas y no se dan en el mismo lugar de la célula. Las diferencias se encue...