Rangkuman Materi HPLC - Lecture notes 1 PDF

Preview

Summary

MAKALAHMETODOLOGI PENELITIAN“ HIGH PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY”Disusun Oleh :Aisyah Nurul Fatma (03031381722093)Almafitri Octavirany Herawati (03031381722083)Anita Zulhadj D. (03031381722087)Yessy Dwi Yulianti (03031381722091)JURUSAN TEKNIK KIMIAFAKULTAS TEKNIKUNIVERSITAS SRIWIJAYA2019Kata Pengan...

Description

MAKALAH METODOLOGI PENELITIAN “ HIGH PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY”

Disusun Oleh : Aisyah Nurul Fatma

(03031381722093)

Almafitri Octavirany Herawati

(03031381722083)

Anita Zulhadj D.

(03031381722087)

Yessy Dwi Yulianti

(03031381722091)

JURUSAN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS SRIWIJAYA 2019

Kata Pengantar Segala puji bagi Allah SWT yang telah memberikan kami kemudahan sehingga kami dapat menyelesaikan makalah ini dengan tepat waktu. Tanpa pertolongan-Nya tentunya kami tidak akan sanggup untuk menyelesaikan makalah ini dengan baik. Shalawat serta salam semoga terlimpah curahkan kepada baginda tercinta kita yaitu Nabi Muhammad SAW yang kita nantinatikan syafa’atnya di akhirat nanti. Penulis mengucapkan syukur kepada Allah SWT atas limpahan nikmat sehat-Nya, baik itu berupa sehar fisik maupun akal pikiran, sehingga penulis mampu untuk menyelesaikan pembuatan makalah sebagai tugas dari mata kuliah Metodologi Penelitian dengan judul “”. Penulis tentu menyadari bahwa makalah ini masih jauh dari kata sempurna dan masih banyak terdapat kesalahan serta kekurangan di dalamnya.Untuk itu, penulis mengharapkan kritik serta saran dari pembaca untuk makalah ini, supaya makalah ini nantinya dapat menjadi makalah yang lebih baik lagi.Demikian, dan apabila terdapat banyak kesalahan pada makalah ini penulis mohon maaf yang sebesar-besarnya. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada semua pihak khususnya kepada dosen pengampu mata kuliah Metodologi Penelitian ,yaitu Pak. Demikian, semoga makalah ini dapat bermanfaat. Terima kasih.

Palembang, Februari 2019

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi cuplikan antara fasa yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fasa diam, dapat berupa zat cair atau zat padat. Kita biasanya menganggap Tswett sebagai penemu kromatografi, yang pada tahun 1903 menguraikan karyanya mengenai pemakaian kolom kapur untuk memisahkan pigmen dalam daun. Istilah ‘kromatografi’ dipakai oleh Tswett untuk menggambarkan daerah berwarna yang bergerak ke bagian bawah kolom Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui fase yang stasioner. Fasa stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair. Pembahasan teknik kromatografi modern, baru lengkap bila disebut High Performance Liquid Cromathography (HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal, HPLC telah terbukti luas penggunaannya dalam kimia organik

1.2 Rumusan Masalah Adapun rumusan masalah dalam makalah ini antara lain:

1. Apa itu High Performance Liquid Cromathography (HPLC)? 2. Apa saja jenis-jenis HPLC? 3. Apa saja instrument alat HPLC? 4. Bagaimana prinsip dan cara kerja HPLC? 5. Bagaimana analisa kualitatif dan kuantitatif HPLC? 6. Apa manfaat dan kegunaan HPLC?

1.3 Tujuan Tujuan dibuatnya makalah ini antara lain: 1. Untuk mengetahui apa itu High Performance Liquid Cromathography (HPLC) 2. Untuk mengetahui jenis-jenis HPLC 3. Untuk mengetahui instrumen alat HPLC 4. Untuk mengetahui prinsip dan cara kerja HPLC 5. Untuk mengetahui analisa kualitatif dan kuantitatif HPLC 6. Untuk mengetahui manfaat dan kegunaan HPLC

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 PENGERTIAN HPLC Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Ini merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam- asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi. Seperti

teknik

kromatografi

pada

umumnya,

HPLC

berupaya

untuk

memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fase cair dan zat padatnya merupakan fase diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karana setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fase diam tertentu dan fase gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa. Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Analisa kualitatif bertujuan untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia dari analat dalam suatu sample. Sedangkan analisa kuantitaif untuk mengetahui jumlah dan konsentrasi analat tersebut dalam sample (Riyadi, 2009). Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair- cair yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram,

dibandingkan dengan luas atau area larutan standar. Pada prakteknya, perbandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar, oleh karena itu maka perbandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi (Cupritabu, 2010). Saat ini, HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan.

2.2 JENIS-JENIS HPLC 1. Kromatografi Adsorbsi Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis.Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

2. Kromatografi fase terikat Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat.Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil.Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau

protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

3.

Kromatografi penukar ion KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak.Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.

Kebanyakan

pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4.

Kromatografi Pasangan ion Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion.Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

5.

Kromatografi Eksklusi Ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus

sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6.

Kromatografi Afinitas Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik.Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

2.3 INSRUMEN ALAT HPLC 1. Fase Gerak dan Reservoir Pelarut Fase gerak pada HPLC harus menggunakan pelarut dengan kemurnian sangat tinggi. Idealnya, pelarut khusus yang memang sudah memenuhi standard untuk HPLC dipergunakan untuk hasil yang lebih akurat. Reservoir pelarut merupakan wadah penyimpanan fase gerak, biasanya berbentuk botol kaca dengan selang penghubung. Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.

Persyaratan fasa gerak HPLC: 1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis. 2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatografi. 3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom. 4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun. 5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise). 6. Sesuai dengan detector. Jenis fasa gerak berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak: a) HPLC fasa normal: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam polar dan fasa gerak nonpolar. Fasa diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fasa gerak yang digunakan adalah heksana atau i-propileter. b) HPLC fasa terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam non-polar dan fasa gerak polar. Fasa gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril. Fasa gerak yang baik memberikan factor kapasitas k’ pada rentang yang sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan fasa gerak yang memberikan k’ antara 2-5.

Kiri: Methanol khusus HPLC ; Kanan: Reservoir yang terhubung ke pompa

2. Pompa

Pompa dalam HPLC dapat dianalogkan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Persyaratan pompa yang digunakan dalam HPLC: 1. Menghasilkan tekanan sampai 600psi (point/in2) 2. Keluaran bebas pulsa 3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 ml/menit 4. Bahan tahan korosi Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC: a) Pompa reciprocating Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung dengan pelarut.Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.

b) Pompa displacement Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut. c)

Pompa pneumatic

Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi.Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa.Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan ( 1 maka senyawa 1 keluar

dari kolom lebih cepat dari pada senyawa 2. Semakin besar harga α , semakin baik pemisahan.

Efisiensi Pemisahan: Tingkat efisiensi pemisahan dengan kromatografi tercermin pada pek-peak kromatogram yang dihasilkan.Semakin lebar suatu peak kromatogram maka dapat dikatakan pemisahan semakin kurang efisien. Parameter efisiensi pemisahan dinyatakan dlam bentuk HETP (height equivalent to a theoretical plate) yang diformulasikan sebagai berikut: H=

L N

Dimana:

H

: HETP (height equivalent to a theoretical plate)

L

: panjang kolom dalam centimeter

N

: jumlah total theoretical plate

Nilai H menunjukkan ukuran efisiensi yang diberikan kolom tiap unit panjang kolom.Nilai H yang kecil menyatakan kolom yang lebih efisien dan nilai N yang besar.Objek yang paling

penting dalam KCKT adalah meminimalkan nilai H sehingga nilai N maksimum dan efisiensi kolom paling tinggi. Nilai H menurun dengan: 1. Ukuran partikel kolom yang kecil 2. Laju alir fase gerak yang rendah 3. Fase gerak yang kurang kental 4. Pemisahan pada temperature tinggi 5. Molekul-molekul sample yang kecil 6. Meningkatkan panjang kolom. Jarak diantara puncak maksimal menunjukkan selektivitas system.Lebar punak kromatografi menunjukkan efisiensi.Efisiensi dan selektivitas merupakan descriptor pelengkap yang tergantung pada parameter-parameter kromatografi yang berbeda-beda. Efisiensi lebih tergantung pada kualitas packing kolom, ukuran partikel, laju alir, dan optimasi instrumental, sedangkan selektivitas lebih tergantung pada komponen fasa diam dan analit itu sendiri. 2.6 KEGUNAAN DAN MANFAAT HPLC Keuntungan dan keterbatasan HPLC Ada beberapa keuntungan HPLC, yaitu: 1.

Dapat menganalisis sampel yang tidak mudah menguap atau tidak stabil dengan pemanasan.

2.

Interaksi yang lebih selektif dengan molekul sample kerena fasa gerak dan fasa diam berperan dalam proses kromatografi.

3.

Berbagai jenis kolom yang selektif.

4.

Menghasilkan pemisahan dengan kecepatan tinggi.

5.

Waktu analisis yang cepat.

6.

Pemasukan sample yang tepat dan mudah dikendalikan sehingga menjamin presisi kuantitatif.

7.

Resiko peruraian sample yang lebih kecil karena tidak dilakukan pemanasan.

8.

Keragaman kolom dan detector berarti bahwa selektivitas metode tersebut dapat disesuaikan dengan mudah.

Keterbatasan HPLC adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPL dihubungkan dengan spektrofotometer massa (MS). Selain itu, keterbatasan lainnya adalah jika sample dianalisis sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh.

Manfaat HPLC 1. Menentukan jumlah morfin dalam larutan diperparah 2. Pemurnian (misalnya untuk keperluan sintesis) senyawa organik skala besar 3. Dalam analisis farrnasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemumian dan penetapan kadar obat-obatan.

BAB III KESIMPULAN Adapun kesimpulan yang dapat diambil dalam makalah ini antara lain: 1. Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. 2. Terdapat 6 jenis HPLC yaitu Kromatografi Adsorbsi, Kromatografi Fase Terikat, Kromatografi Penukar Ion, Kromatografi Pasangan Ion, Kromatografi Ekslusi Ukuran, Kromatografi Afinitas. 3. Instrumen alat HPLC antara lain Fase Gerak dan Reservoir Pelarut, Pompa, Injektor, Sampel, Kolom HPLC, Detektor, dan Pengolah Data

4. Prinsip kerja HPLC yaitu pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya dan cara kerja HPLC adalah dengan dengan bantuan pompa fasa gerak air dialirkan melalui kolom kedetector 5. HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar. 6. Manfaat HPLC antara lain Menentukan jumlah morfin dalam larutan diperparah, pemurnian (misalnya untuk keperluan sintesis) senyawa organik skala besar, dan dalam analisis farrnasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemumian dan penetapan kadar obat-obatan....