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resumen de microscopia de fluorescencia para biología molecular...

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MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA

Introducción ¿Qué es un microscopio de fluorescencia? Un microscopio de fluorescencia es un microscopio óptico al que se le adapta un accesorio complementario de iluminación que otorga “fluorescencia” el cual otorga una observación de contraste con fluorescencia.

Introducción a la fluorescencia: un poco de historia las moléculas susceptibles emiten luz a partir de estados excitatorios. Que son creados electrónicamente por un mecanismo físico (por ejemplo, absorción de luz), mecánico (fricción) o químico.

La fotoluminiscencia: es la generación de luz al excitar una molécula a través de fotones lumínicos Este se divide formalmente en dos categorías, fluorescencia y fosforescencia. Dependiendo de la configuración electrónica del estado excitado y la vía de emisión.

La fluorescencia es la propiedad de algunos átomos y moléculas para absorber la luz a una longitud de onda particular. Y, posteriormente, emitir luz de onda más larga después de un breve intervalo, denominada vida útil de fluorescencia.

El proceso de fosforescencia se produce de manera similar a la fluorescencia, pero con un tiempo de vida excitado mucho más prolongado. Proceso de fluorescencia La excitación de una molécula susceptible por un fotón entrante ocurre en femtosegundos (1015 seg). Mientras que la relajación vibratoria de los electrones en estado excitado al nivel de energía más bajo es mucho más lenta; y se puede medir en picosegundos (1012 seg).

El proceso final es la emisión de un fotón de longitud de onda más larga y el retorno de la molécula al estado fundamental. Este ocurre en el período de tiempo relativamente largo de nanosegundos (109 seg). Toda la vida útil de la fluorescencia molecular, desde la excitación hasta la emisión, se mide en solo mil millonésimas de segundo

Debido a los perfiles de emisión tan sensibles, la resolución espacial y la alta especificidad de las investigaciones de fluorescencia, la técnica se ha convertido en una herramienta importante en genética y biología celular.

Varios investigadores informaron sobre fenómenos de luminiscencia durante los siglos XVII y XVIII. Pero fue el científico británico Sir George G. Stokes quien describió por primera vez la fluorescencia en 1852. Él acuñó el término en honor a la fluorita mineral fluorescente azul-blanco.

Stokes también descubrió el cambio de longitud de onda a valores más largos en los espectros de emisión que llevan su nombre (conocido como Ley de Stokes Primeros microscopios de fluorescencia Los primeros microscopios de fluorescencia fueron desarrollados entre 1911 y 1913. Por los físicos alemanes Otto Heimstaedt y Heinrich Lehmann como un “sucedáneo” del microscopio ultravioleta. Estos se emplearon para observar la autofluorescencia en bacterias, tejidos animales y vegetales.

Poco después, Stanislav Von Provazek impulsó una nueva era cuando usó la microscopía de fluorescencia para estudiar la unión del tinte en tejidos fijos y células vivas. Sin embargo, no fue hasta principios de la década de 1940 que Albert Coons desarrolló una técnica para etiquetar anticuerpos con colorantes fluorescentes. Esto dio lugar al campo de la inmunofluorescencia.

A comienzos del siglo XXI, el campo de la microscopía de fluorescencia provocó una revolución en la biología celular. Este unió al poder de las imágenes de células vivas, el marcado múltiple altamente específico de orgánulos individuales y complejos macromoleculares. Lo hicieron utilizando sondas fluorescentes sintéticas y genéticamente codificadas.

Otros modos Hay otros modos de microscopía óptica que se basan en características de muestras macroscópicas. Tales como gradientes de fase, absorción de luz y birrefringencia. A diferencia de estos la microscopía de fluorescencia es capaz de obtener imágenes de la distribución de una sola especie molecular. Esto basada únicamente en las propiedades de emisión de fluorescencia. Por lo tanto, utilizándola se puede controlar la ubicación precisa de los componentes intracelulares marcados con fluoróforos específicos. Así como sus coeficientes de difusión asociados, características de transporte e interacción con otras biomoléculas.

Además, la intensa y evidente respuesta en la fluorescencia a las variables ambientales localizadas permite investigar el pH, la viscosidad, el índice de refracción. Así como las concentraciones iónicas, el potencial de membrana y la polaridad del disolvente en células y tejidos vivos.

¿Para qué sirve el microscopio de luz fluorescente?

1.Calidad de alimentos: Estos sirven para contar los microbios presentes en los productos con alimentos, esto sirve para proteger a los consumidores 2: Diagnostico: Los funcionarios de la salud Pueden investigar órganos para ver si tienen enfermedades como la malaria o tuberculosis 3: Química: Los químicos ocupan esto para excitar los átomos y ver el comportamiento de sus electrones 4: Neurociencia: Estos se utilizan para estudiar el comportamiento y la organización del cuerpo humano EJ: la sinopsis y señales nerviosas

Microscopio de epifluorescencia:

La fluorescencia acoplada a un microscopio tradicional se le llama epifluorescencia, ya que se inserta por encima del sistema óptico (objetivos de aumento), trabajando por reflexión lumínica El microscopio óptico debe tener algunas especificaciones únicas pata hacer el trabajo de bioindicación con fluorescencia.

Los fabricantes diseñan objetivos con lentes de fluorita con mayor transmisión lumínica para estos efectos. Aunque son más caros que los convencionales. Pero con una buena definición (Apertura Numérica)

Así pues, el accesorio de fluorescencia es un sistema de iluminación complementario. Con un funcionamiento similar al

del microscopio óptico convencional. Pero con unas particularidades que lo hacen diferente.

Montaje de los filtros: para el diagnóstico FISH se utilizan moléculas que incorporan un determinado fluoróforo o fluorocromo el cual es un colorante. Con el fin de que cuando se ilumina con una fuente de luz podamos verlo con un color determinado. A nivel molecular la cantidad de luz percibida es muy pobre y si iluminamos con luz blanca una molécula de color no podremos distinguirla. Para ello se utilizan filtros específicos para seleccionar e iluminar solo la muestra con una zona determinada del espectro visible. Estos son filtros de excitación.

Para ver este fluorocromo en un microscopio de fluorescencia, utilizaremos filtros que acoten la longitud de onda azul de iluminación o filtros de excitación. Y también filtros de barrera que permitirán ver la fluoresceína en color verde y no el resto de colores.

La ley de Stokes y los filtros de fluorescencia: El sistema de iluminación convencional del microscopio nos permite ver la muestra por transmisión. Esto porque la luz atraviesa la muestra, se recoge en el objetivo formando la imagen y se aumenta en el ocular para enfocarla y hacerla visible.

Por su parte, en el microscopio de fluorescencia la muestra la vemos por reflexión de la luz. En este caso la luz se transmite desde la lámpara de vapor de mercurio mediante el sistema colector de luz hasta el objetivo de aumento

Es por la ley de física óptica de Stokes Cuando iluminamos un objeto con luz blanca el color con el que lo vemos corresponde al que más refleja

Componentes del microscopio de epifluorescencia: 1.Una fuente de alimentación eléctrica. 2.Un portalámparas que incluye una lámpara de vapor de mercurio. Que es mejor que una lámpara halógena o de tipo led. 3.Un sistema colector de luz y unos filtros de fluorescencia específicos.

La fuente de alimentación incluye un transformador independiente que alimenta la lámpara. También un contador horario para controlar las horas de funcionamiento de la lámpara. Ya que éstas tienen una vida corta y sus particularidades de emisión disminuyen con el paso del tiempo

El portalámparas, que alberga la lámpara de vapor de mercurio, debe estar bien ventilado (estas lámparas desprenden mucho calor), con protección térmica de seguridad para evitar quemaduras por descuidos. Y tiene que incluir un sistema de centrado de la lámpara en los tres ejes. Al iluminar una zona muy pequeña (microscópica) deberemos poder concentrar bien la luz emitida sobre nuestra muestra

Esto lo conseguiremos centrando la lámpara con el eje óptico (eje Y) y con la muestra enfocada (eje X). El tercer eje “Z” nos permite desplazar ligeramente la lámpara hacia un lado, evitando que el reflejo de luz del espejo de reflexión que existe en el portalámparas coincida con la propia lámpara, evitando el sobrecalentamiento de esta.

La lámpara de vapor de mercurio, de alta presión, genera un arco eléctrico incandescente en los polos positivo/negativo dónde se concentran las moléculas gaseosas de mercurio. Emite una luz blanca muy intensa que concentraremos sobre la muestra.

Montaje de los filtros;

el fabricante monta 3 tipos de piezas: filtros de excitación, de barrera y un espejo dicroico, desplazable respecto al eje óptico para poderlo intercalar según hagamos la observación puede ser convencional o con fluorescencia, entre mejores filtros elijamos, más nítida la imagen, el fondo oscuro y la fluorescencia contrastada.

Bibliografía: https://www.bioindicacion.com/blog/que-es-microscopio-fluorescencia/ https://www.ipb.csic.es/servicios/Microscopia/uploads/3/6/2/2/3622788/microscopia_a_grandes _rasgos.pdf http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0187-893X2015000100008...