Sisilia Fil Jannati PKB 18 18030194012 Laporan Resmi Praktikum Isolasi DNA Epithelial Mulut PDF

Preview

Summary

LAPORAN RESMI PRAKTIKUMLABORATORIUM : BIOKIMIAPRAKTIKUM : BIOKIMIAJUDUL PERCOBAAN : ISOLASI DNA EPITHELIALMULUTOleh :Nama : Sisilia Fil Jannati NIM : 18030194012 Kls : PKB 2018Program/Jurusan : S1 Pendidikan Kimia/KimiaJURUSAN KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUANALAMUNIVERSITAS NEGERI SURAB...

Description

LAPORAN RESMI PRAKTIKUM

LABORATORIUM

: BIOKIMIA

PRAKTIKUM

: BIOKIMIA

JUDUL PERCOBAAN : ISOLASI DNA EPITHELIAL MULUT

Oleh :

Nama : Sisilia Fil Jannati NIM : 18030194012 Kls : PKB 2018

Program/Jurusan : S1 Pendidikan Kimia/Kimia

JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI SURABAYA

A. Judul Percobaan

: Isolasi DNA Epithelial Mulut

B. Hari/Tanggal Percobaan

: Rabu, 27 Oktober 2021 Pukul 13.00 WIB

C. Selesai Percobaan

: Rabu, 27 Oktober 2021 Pukul 15.30 WIB

D. Tujuan Percobaan

:

Mampu mengerjakan isolasi DNA sesuai prosedur dengan sampel diambil dari epithelial mulut E. Dasar Teori 1. Epithelial Mulut Epithelium berasal dari kata epi yang berarti upon atau di atas dan thele yang berarti nipple atau punting. Penggunaan istilah epitel meluas untuk semua bentuk lapisan yang terdiri atas lembaran sel-sel (cellular membrane) baik yang bersifat tembus cahaya ataupun yang tidak. Dengan berkembangnya pemakaian mikroskop, maka istilah epitel tidak terbatas pada kumpulan sel yang membentuk membran yang menutupi, tetapi juga digunakan untuk kelenjar. Hal tersebut didukung dengan hasil penelitian embriologis yang menyimpulkan bahwa sel-sel epitel pada permukaan tumbuh ke dalam jaringan pengikat di bawahnya dan berkembang menjadi kelenjar (Campbell, 2008). Epitel dalam arti luas dikelompokan menjadi : a.

Jaringan yang sel-selnya tersusun dalam lapisan yang menutupi permukaan luar atau melapisi rongga di dalam tubuh yang dinamakan epitel permukaan, mereka dapat digolongkan sesuai jumlah lapisan sel dan morfologi sel pada lapisan permukaan.

b.

Jaringan epitel yang tumbuh ke dalam jaringan pengikat menjadi epitel kelenjar, jaringan epitel kelenjar meliputi sel-sel dengan fungsi khusus menghasilkan cairan sekresi yang komposisinya berbeda dari darah atau cairan interseluler. Proses ini biasanya disertai proses makromolekul intraseluler. Persenyawaan ini biasanya ditampung di dalam sel dalam vesikel-vesikel kecil bermembran yang disebut granul sekresi. Epitel dapat berkembang dari ketiga lapis embrional. Epitel yang

melapisi kulit, mulut, hidung, dan anus berasal dari ektoderm. Pelapis sistem pernapasan, saluran cerna, dan kelenjar dari saluran cerna (misalnya,

pancreas dan hati) berasal dari endoderm. Epitel lainnya (misalnya, endotel pelapis pembuluh darah) berasal dari mesoderm. Fungsi umum membran epitel : 1) Proteksi Sebagai pelindung untuk melapisi permukaan dalam dan luar tubuh. 2) Absorbsi Epitel yang membatasi permukaan dalam usus selain berfungsi sebagai pelindung juga berperan dalam proses penyerapan hasil-hasil pencernaan makanan. 3) Lubrikasi Sebagian besar saluran-saluran dalam tubuh permukaannya harus tetap basah, sehingga epitel yang menutupi harus mampu menghasilkan cairan tertentu, misalnya epitel yang melapisi vagina. 4) Sekretori Epitel bertindak sebagai kelenjar. Salah satu komponen sistem pertahanan rongga mulut dari pengaruh berbagai factor lingkungan adalah jaringan mukosa mulut. Struktur dan fungsi mukosa mulut bersifat transisi antara kulit dan mukosa traktus gastrointestinalis. Mukosa mulut menyerupai mukosa intestine karena secara konstan dibasahi oleh cairan (mucus) dan lapisan ephiletnya memiliki kemampuan regenerasi yang tinggi. Tetapi mukosa mulut juga menyerupai kulit karena memiliki lapisan ephitel berlapis gepeng yang di banyak region mempunyai lapisan keratin. Dengan strukturnya yang spesifik tersebut mukosa mulut mampu berperan sebagai pelindung jaringan lunak dibawahnya dari kekuatan fisik yang berpotensi merusak akan tetapi juga cukup lentur dan tahan untuk mengakomodasi proses pembentukan makanan menjadi bolus. Mukosa mulut juga berfungsi sebagai barrier terhadap mikroorganisme, toksin, dan berbagai antigen (Puspitawati, 2003). Mukosa mulut terdiri dari epitelium yang ditutupi mukus dan terdiri dari stratum distentum, stratum filamentosum, stratum suprabasale dan stratum basale. Epitelium bisa terdiri dari lapisan tunggal (single layer) yang terdapat pada lambung usus kecil dan usus besar serta bronkus, ataupun

lapisan ganda (multiple layer) seperti pada esophagus dan vagina. Lapisan paling atas terdiri dari goblet sel yang mensekresikan mukus ke permukaan epitelium. Permukaan lembab pada jaringan mukosa adalah akibat adanya mukus yang berlendir, kental dan terdiri dari glikoprotein, lipid, garam inorganic, dam lebih dari 95% air. Di bawah epitelium terdapat basal lamina, lamina propia dan

submukosa. Epitelium memberikan barrier

mekanis yang dapat melindungi jaringan di bawahnya, lamina propia bertindak sebagai penahan mekanis dan juga membawa pembuluh darah dan sel saraf. Tebal lapisan mukus

bervariasi pada tiap-tiap jaringan

mukosa, biasanya antara 50-500 µm pada saluran cerna dan kurang 1 µm pada rongga mulut (Punitha dan Girish, 2010). Jaringan ephitel mukosa mulut adalah ephitel berlapis gepeng. Sel-sel ephitel mukosa mulut terdiri dari empat lapisan berturut-turut dari yang paling dalam ke permukaan yaitu lapisan germinativum/basalis, lapisan spinosum, lapisan granulosum, dan lapisan corneum. Struktur yang terdiri dari beberapa lapisan tersebut mencerminkan adanya proses pertumbuhan dan pematangan sel. Sel-sel di satu lapisan secara kontinyu digantikan oleh sel-sel dari lapisan di bawahnya (Puspitawati, 2003). Berikut ini merupakan struktur epitel rogga mulut :

Gambar Struktur Epitel Rongga Mulut

2. DNA (Deoxyribonucleic acid) DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup yang membawa keterangan genetik dari sel khusunya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya (Suryo, 2012). DNA dan protein histon merupakan komponen utama dari kromosom eukaryote. Protein histon bersifat basa sehingga dapat menetralkan sifat asam dari asam nukleat. Sel memiliki dua asam nukleat yaitu DNA dan RNA, DNA yang ditemukan pada inti sel disebut DNA inti, sedangkan DNA yang diterdapat didalam sel namun terletak diluar inti sel disebut DNA kloroplas (tanamam). DNA merupakan asam nukleat yang mengandung materi genetik yang berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler (Yuwono, 2009). DNA merupakan polimer dari nukleotida yang masing-masing terdiri atas tiga komponen yaitu basa nitrogen, gula pentose, dan gugus fosfat. Basa dalam DNA dapat berupa adenine (A), timin (T), guanine (G), dan sitosin (C) (Campbel, 2008). DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA berfungsi untuk menyimpan informasi genetik secara lengkap yang diperlukan untuk mencirikan struktur semua protein dan RNA tiap-tiap spesies organisme, untuk membuat program pada saat yang tepat dan menempatkan biosintesis sel dan jaringan secara teratur, untuk menentukan aktivitas organisme sepanjang siklus hidupnya, dan untuk menentukan kekhususan organisme tertentu (Lehninger, 1982). DNA, Deoxyribose Nucleic Acid adalah asam nukleotida, biasanya dalam bentuk heliks ganda yang mengandung instruksi genetik yang menentukan perkembangan biologis dari seluruh bentuk kehidupan sel. DNA berbentuk polimer panjang nukleotida, mengkode barisan residu asam amino dalam protein dengan menggunakan kode genetik, sebuah kode nukleotida triplet. DNA seringkali dirujuk sebagai molekul hereditas karena ia bertanggung jawab untuk penurunan sifat genetika dari kebanyakan ciri yang diwariskan. Pada manusia, ciri-ciri ini misalnya dari warna rambut

hingga kerentanan terhadap penyakit. Selama pembelahan sel, DNA direplikasi dan dapat diteruskan ke keturunan selama reproduksi (Peyrard, 2004). DNA pertama kali berhasil dimurnikan pada tahun 1868 oleh ilmuwan Swiss Friedrich Miescher, di Tubingen, Jerman yang menamainya nuclein berdasarkan lokasinya di dalam inti sel. Namun demikian, penelitian terhadap peranan DNA di dalam sel baru dimulai pada awal abad 20, bersamaan dengan ditemukannya postulat genetika Mendel. DNA dan protein dianggap dua molekul yang paling memungkinkan sebagai pembawa sifat genetis berdasarkan teori tersebut. (Van Berkum, 1995). Komponen satu nukleotida terdiri dari tiga bagian yaitu gula pentosa (deoksiribosa pada DNA dan robosa pada RNA), basa nitrogen, dan gugus fosfat. Basa nitrogen yang menyusun asam nukleat adalah basa purin (adenin = A, guanin = G) serta basa pirimidin (sitosin = C, timin = T, urasil = U). Timin hanya terdapat pada DNA sedangkan urasil hanya terdapat pada RNA (Yuwono, 2009). Pada keadaan normal di dalam sel, DNA terdiri dari rantai ganda yang disebut dengan double helix, struktur ini terbentuk karena ikatan hidrogen antar basa nukleotida. Aturan ikatan antar basa nukleotida tersebut adalah adenin hanya dapat berpasangan dengan timin, sedangkan guanin hanya dapat berpasangan dengan citosin. Adenin dan timin diikat oleh 2 ikatan hydrogen. Molekul DNA terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas (Agus dan Sjafaraenan, 2014). DNA yang menyusun kromosom merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda (double helix), dimana basa nitrogen dan kedua benang polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat (Jamilah, 2005). Struktur DNA double helix ialah sebagai berikut :

Gambar Struktur DNA double helix Menurut Peyrard (2004), DNA adalah resep, skema, sistematika, manual, peta, cetak biru, rancangan, dan informasi biologis yang unik dari makhluk hidup. Persis seperti setiap bangunan gedung yang ada cetak birunya masing-masing. Tidak hanya bentuk fisik makhluk hidup, tapi juga sifat, lewat keturunan. Jadi sifat manusia bisa terbentuk dari 2 hal: a) Turunan genetis dari orang tua b) Unsur Lingkungan DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan. DNA terdapat di nukleus, mitokondria, dan kloroplas. DNA memiliki struktur helix utas ganda, yang mengandung komponen komponen gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Satu sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan akan diturunkan pada keturunannya (Tim Dosen Biokimia, 2021) 3. Isolasi DNA Proses pengeluaran DNA dari inti maupun pada organel (kloroplas dan mitikondria) inilah yang dikenal dengan istilah isolasi DNA atau ekstraksi DNA (Fachtiyah, 2011). DNA dapat diisiolasi baik pada manusia

maupun tumbuhan. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari suatu DNA (Tim Dosen Biokimia, 2021). Isolasi DNA merupakan pemisahan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel ian. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganiems, atau sel manusia. Isolasi DNA merupakan suatu proses untuk mendapatkan DNA murni yang digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau diagnosa (Steven, 2007). Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Isolasi DNA merupakan kegiatan yang dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA (Jamilah, 2005). Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader 1993). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell, 2008). DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA dari hewan lebih banyak mengandung protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitif oleh enzim restriksi dan menggangu proses amplifikasi DNA dengan PCR. Demikian pula pada hewan yang memiliki kandungan kitin

(seperti serangga), memerlukan teknik dan metode khusus untuk menghancurkan sel hingga isi dapat terpisah atau keluar dari sel. (Kusumawati, 2012). 4. Macam-Macam Metode Isolasi DNA Terdapat berbagai macam metode isolasi DNA. Metode isolasi DNA antara lain : a. Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Teknik pengujian polimorfisme DNA merupakan teknik isolasi DNA berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-segmen DNA acak yang menggunakan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukan secara acak.Primer tunggal ini biasanya berukuran 10 basa.PCR dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang memungkinkan primer menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk primer adalah terdiri atas 18- 28 susunan basa dengan persentase G+C 50-60% (Istanti, 1999). b. Metode CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) merupakan metode yang umum digunakan dalam ekstraksi DNA genom tanaman yang banyak mengandung polisakarida dan senyawa polifenol

(Ardiana,

2009). Metode ini menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Prasetyo, 2008). c. Phenol Chloroform Pada metode ini mengunakan senyawa Phenol-choloroformisoamyl alcohol. Namun metode ini sekarang ditinggalkan, karena sifat toksik phenol (Barnum, 2005). Metode tertua pemurnian DNA di laboratorium, masih sering digunakan juga, mengandalkan campuran pelarut organik. Sampel yang sudah lisis dicampur dengan fenol, kloroform, dan isoamylalcohol untuk pemisahan DNA dan protein.

Protein didenaturasi dengan campuran organik. Ketika sampel disentrifugasi, DNA dipertahankan dalam air lapisan, fenol di bagian bawah tabung, dan protein didenaturasi membentuk antarmuka berawan. Metode ini sangat efisien, tetapi sayangnya hanya dapat digunakan jika jumlah bahan awal cukup melimpah. Selain itu, pelarut organik yang digunakan membawa masalah kesehatan dan keselamatan. Kualitas DNA dari prosedur ini biasanya tidak cukup untuk beberapa teknik analitis lebih sensitif (terutama sequencingdan kadang-kadang PCR). d. Salting Out Salting out merupakan metode isolasi DNA yang menggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M) untuk medenaturasi protein menggunakan Proteinase K untuk denaturasi protein (Barnum, 2005). e. Guanidine Isothiocyanate Metode ini lebih cepat dibandingakn dengan metode yang lain. Namun senyawa thiosyanate yang digunakan untuk lisis dinding sel bersifat toksik serta memerlukan kloroform untuk denaturasi protein (Barnum, 2005). f. Silica Gel Pada metode ini, silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam atau buffer tertentu misalnya NaI. Metode ini cepat tetapi untuk recovery DNA kurang (Barnum, 2005). g. PCR (Polymerase Chain Reaction) Metode ini merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida.Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif (Giri, 2004). 5. Tahapan Isolasi DNA Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi (Tim Dosen Biokimia, 2021).

1) Sentrifugasi Sentrifugasi

merupakan

teknik

untuk

memisahkan

campuran

berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada pada bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Teknik sentrifugase dilakukan oleh mesin yaitu mesin sentrifugase dengan kecepatan yang bervariasi. Hasil sentrifugase akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatant dibagian atas dan pellet dibagian bawah (Tim Dosen Biokimia, 2021) 2) Presipitasi Menurut tim dosen biokimia (2021), pada presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran. Langkah-langkah isolasi DNA ialah sebagai berikut : 1) Pengumpulan sel-sel Pada tahapan ini, sel-sel dikumpulkan untuk dilakukan isolasi DNA sehinggdiapatkan DNA yang murni. 2) Pemecahan sel (lisis sel) dan pencernaan protein Pada prinsipnya isolasi DNA sel harus dipecah terlebih dahulu dengan beberapa agensia, baik secara fisik kimia atau dengan mempergunakan enzim tertentu. Pemecahan dengan cara fisik misalnya dengan menggunakan alat sonikator, yaitu merupakan alatb yang menghasilkan suara ultra tinggi. Pemecahan dengan alat ini biasanya cukup fektif untuk memecah sel bacteri, tetapi kurang efektif untuk memecah sek eukaryote. Pemecahan sel juga dapat dilakukan dengan menggunakan enzim lisozim yang dapat memecah dinding sel. Seringkali penggunaan enzim ini dikombinasikan dengan perlakuan fisik, misalnya dengan pemansan sehingga sel lebih mudah pecah. Senyawa lain yang sering digunakan untuk memecah sel untuk isolasi DNA adalah CTAB (Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide). 3) Pengendapan DNA

DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi. Pada umumnya digunakan etanol atau isopropanol dalam tahapan presipitasi. Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi. Presipitasi juga berfungsi untuk menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal dari tahapan ekstraksi. Menurut Surzycki (2000), prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama, menurunkan kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari air berinteraksi dengan muatan negatif pada gugus fosfodiester DNA. Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air. Isopropanol dapat bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air. Molekul isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar dari asam nukleat sehingga isopropanol adalah pelarut yang lemah bagi asam nukleat; kedua, penambahan isopropanol akan menghilangkan molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi; ketiga, penggunaan isopropanol dingin akan menurunkan aktivitas molekul air sehingga memudahkan presipitasi DNA. Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa (Mangoendidjojo, 2003). 6. Enzim yang terlibat pada DNA Berikut ini merupakan beberapa enzim yang terdapat dan terlibat dalam DNA : a. Enzim Nuklease Asam nukleat baik DNA maupun RNA mampu dipotong dengan menggunakan suatu enzim yaitu nuklease. Enzim nuklease yang mampu memotong RNA disebut ribonuklease atau Rnase, sementara enzim yang mampu memotong DNA disebut deoksiribonuklease atau Dnase. Beberapa nuklease hanya memotong urutan asam nukleat yang single

strand dan apa pula yang mampu memotong asam nukleat yang double strand. Nuklease ada dua macam yakni eksonuklease yang mampu memotong molekul asam nukleat single strand atau beberapa oligonukleotida pendek yang hanya mengenali salah satu ujung asam nukleat, yaitu ujung 5′ atau ujung 3′; sementara endonuklease mampu memotong asam nukleat di dareah tengah daru sekuens asam nukleat yang mampu mengenali daerah spesifik pada urutan asam nukle...