Laporan Isolasi DNA Buah PDF

Preview

Summary

©FRONEXTON™‖Science One BAB I PENDAHULUAN 1.1 LATAR BELAKANG Pada dasarnya, sel mengandung dua asam nukleat yaitu DNA dan RNA. DNA terletak pada kromosom, dijumpai di nukleus, mitokondria dan kloroplas. Sedangkan RNA dijumpai di nukleus, sitoplasma, dan ribosom. DNA ada dalam setiap sel makhluk hidu...

Description

©FRONEXTON™‖Science One

BAB I PENDAHULUAN 1.1 LATAR BELAKANG Pada dasarnya, sel mengandung dua asam nukleat yaitu DNA dan RNA. DNA terletak pada kromosom, dijumpai di nukleus, mitokondria dan kloroplas. Sedangkan RNA dijumpai di nukleus, sitoplasma, dan ribosom. DNA ada dalam setiap sel makhluk hidup. Zat ini disebut cetak biru kehidupan karena memiliki peranan yang sangat penting, yaitu sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain. DNA bisa mengalami denaturasi dan renaturasi. Banyak hal yang mempengaruhi prosestersebut, antara lain suhu yang tinggi, pH ekstrim, kandungan elektrolit Na+ atau K+ dan komposisi basa C-G. (Hays, 2005). Untuk mendapatkan DNA murni dari suatu sel dalam jaringan tubuh makhluk hidup dapat dilakukan suatu teknik isolasi DNA. Zubaidah (2004: 38) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis maupun bagian tanaman dapat menimbulkan masalah berbeda, antara lain karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA dan juga mempengaruhi enzim-enzim seperti polimerase, ligase, endonuklease restriksi, atau enzim untuk kegiatan molekuler lain yang dapat menyebabkan DNA tidak dapat digunakan untuk aplikasi penelitian. 1.2 RUMUSAN MASALAH 1. Metode Apa saja yang digunakan dalam melakukan isolasi ( pemisahan) DNA khususnya pada buah ? 2. Bagaimanakah tahapan – tahapan dalam melakukan pengamatan isolasi DNA ? dan apa saja tujuan dari setiap langkah yang dilkukan ? 3. Dengan menggunakan meode isolasi yang kalian gunakan, detergen manakah yang terbukti lebih efektif untuk mengamati DNA buah ?, dan mengapa dapat terjadi demikian ?

1

©FRONEXTON™‖Science One

a. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN 1. Untuk mengetahui cara atau metode mengisolasi DNA pada buah 2. Untuk mengetahui keefektifan deterjen dan buah pada percobaan isolasi DNA. 3. Menambah kekayaan ilmu pengetahuan tentang ilmu biologi molekuler 4. Sebagai acuan sumber belajar, sekaligus sebagai pengetahuan awal dalam penelitian berikutnya, terutama menegenai materi DNA 5. Mengetahui gen yang terdapat dalam mahluk hidup, guna mempermudah dalam mempertahankan keanekaragaman hayati, dan memperole h bibit unggul melalui persilangan.

1.4 METODE PENULISAN metode penulisan yang digunakan dalam penyusunan karya tulis ini adalah metode Pengamatan , dan literature.

1.5 LANDASAN TEORI DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Molekul DNA terdapat pada nukleus, mitokondria, plastida dan sentriol. Molekul DNA pada nucleus memiliki bentuk sebagai benang lurus dan tidak bercabang, sedangkan DNA yang terletak pada mitokondria dan plastida berbentuk lingkaran (Suryo, 2012 : 59). DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi.

Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk

memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan

2

©FRONEXTON™‖Science One

sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA. Setelah menunggu beberapa saat terjadi presipitasi pada lapisan atas bukan lapisan bawah, yang menunjukkan bahwa DNA tidak larut dalam etanol tetapi larut dalam air. Ketika molekul DNA terlarut, mereka tersebar dalam larutan sehingga tidak terlihat. Ketika molekul tersebut berpindah kedalam larutan yang bukan pelarut meraka akan berkumpul/ menggumpal sehingga dapat dilihat. Presipitat DNA terlihat seperti serabut-serabut putih yang terkumpul diatas permukaan larutan karena masa jenis etanol lebih kecil dari pada masa jenis air. Etanol yang digunakan harus benar-benar dingin dan berasal dari lemari pendingin, Apabila

etanol

hal ini bertujuan yang

digunakan

untuk

kurang

menyempurnakan presipitasi. dingin,

maka

mengakibatkan

pembentukan presipitat kurang sempurna. DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme (Jamilah, 2005). DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999). Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda

(double

helix),

dimana

basa

nitrogen

dan

kedua

”benang”

polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup dan disebut sebagai ”cetak biru kehidupan” karena molekul ini berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain (Jamilah, 2005). DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi. Zubaidah (2004) dalam Jamilah (2005) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melauli tahapan-tahapan antara lain: preparasi esktrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun

3

©FRONEXTON™‖Science One

isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air yang pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda pula. Buah dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan buah berkadar air rendah. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit. Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan dengan hati-hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada DNA. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik dengan cara mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik bisa dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dengan pemberian yang dapat merusak membran sel dan membran inti, salah satunya adalah deterjen. Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena deterjen dapat menyebabkan rusaknya mebran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa ”lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Machmud, 2006).

4

©FRONEXTON™‖Science One

BAB II METODOLOGI PENELITIAN 2.1. ALAT DAN BAHAN

 Alat o o o o o o o o o o o  Bahan o o o o o o

Beaker gelas Pisau Pengaduk Penyaring (tissue/kapas) Mesin blender Spatula Tabung reaksi dan rak tabung reaksi Gelas kimia Pipet tetes Gelas ukur Corong saring Buah (Tomat, papaya, pisang,stroberi,sawi, kangkung ) Deterjen (rinso, attack, bukrim) Aquades Garam dapur (NaCl) Etanol 96% Es batu

2.2.LANGKAH KERJA a. Deterjen dilarutkan (rinso, attack, dan bukrim) ke dalam 60 ml aquades, diaduk perlahan selama 15 menit dan jangan sampai berbusa. b. Ambil 100 gr daging buah ditambah 100 ml aquades, dimaukan kedalam mesin blender, kemudian diblender selama 40 detik c. Lalu dicampurkan maing- masing 4 ml larutan sabun dengan 4 ml jus buah. d. Menambahkan 1 spatula garam dapur kemudian diaduk selama 10 menit sampai diperoleh campuran yang homogen e. Lalu, saring campuran yang dihasilkan pada point sebelumnya sebanyak 2 kali f. 6 ml hasil penyaringan pada point diatas dimasukan kedalam tabung reaksi dan menambahkan 5 ml etanol 96% dingin

5

©FRONEXTON™‖Science One

g. Amati proses timbulnya DNA, meliputi waktu yang diperlukan,bentuk, warna, srta banyak sedikitnya DNA yang terbentuk 2.3.VARIABLE Variabele Terikat

: Jumlah aquades yang diberikan, waktu penghancuran buah ( blender )

Variabele Bebas

: banyaknya detergn

Variabele Kontrol

: jumlah DNA yang dihasilkan

2.4.HIPOTESIS Hipotesis

1

= Dalam pengamatan Isolasi DNA pada buah, detergen Cream lebih efektif digunakan karena memiliki daya rusak memberan sel yang tinggi tinggi

Hipotesis

0

= Dalam Pengamatan isolasi DNA detergen berbentuk cream tidak efektif digunakan sebab warna hasil filtrasinya tidak bagus

6

©FRONEXTON™‖Science One

BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1. DNA DAN METODE ISOLASI Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA yang telah dikembangkan sangat mahal dan memerplukan waktu yang lama. (Listanto,1996) DNA dapat diisolasi dari berbagai sel atau jaringan baik hewan, tumbuhan maupun manusia. Isolasi DNA merupakan teknik awal dalam pemanfaatan DNA untuk berbagai tujuan. Sebenarnya telah ada metode standar dalam mengisolasi DNA, misalnya teknik atau metode yang dikemukakan oleh Sambrook (1989). Isolasi DNA dari sel maupun jaringan eukariotik, misalnya dari jaringan tumbuhan maupun hewan dilakukan melalui tahap penghancuran sel (lisis), penghilangan RNA dan protein serta pemurnian DNA. isolasi DNA ini membutuhkan alat-alat canggih dan bahan-bahan yang cukup mahal, misalnya EDTA ( Etilendiamin tetra asetat ) yang berfungsi sebagai merusak sel dengan cara mengikat ion Magnesium yang berfungsi mempertahankan integritas sel, SDS ( Sodium dodesil sulfat ) yang dapat melarutkan membrane sel, mendenaturasi protein, enzim proteinase K yang mendegradasi protein, RNAse mendegradasi RNA serta NaCl dan chloroform untuk memurnikan DNA. Modifikasi teknik isolasi DNA telah dilakukan pada beberapa laboratorium, misalnya pada takaran bahan-bahan yang digunakan atau penguraian/ penggantian jenis bahan yang digunakan sesuai denga sel/ jaringan sumber DNA. Teknik/ metode isolasi DNA yang sangat sederhana adalah metode Kitchen Preparation. Metode isolasi ini memanfaatkan bahanbahan yang biasanya digunakan ibu rumah tangga yaitu sabun cuci (cair, bubuk atau krim) untuk menggantikan bahan utama yang berfungsi untuk melisis sel, ekstrak buah nanas sebagai sumber enzim protease serta garam dapur. Isolasi DNA metode Kitchen Preparation menggunakan detergen sebagai alternative pengganti EDTA dan SDS, garam dapur sebagai pengganti NaCl analitik dan jus nanas sebagai pengganti enzim protease. Sedangkan bahan yang akan dilihat DNA nya adalah strowberi, hal ini dikarenakan strowberi mudah dihancurkan. Selain itu, strowberi matang menghasilkan enzim pectinase dan selulase yang membantu memecah dinding sel. Strowberi yang umum dibudidayakan adalah octoploid dengan delapan set genom. Hal ini sangat baik untuk menunjukkan ekstraksi DNA karena memiliki delapan dari

7

©FRONEXTON™‖Science One

setiap jenis kromosom yang juga dikatakan bahwa strowberi memiliki DNA yang berlimpah. Perbedaan Isolasi DNA Kasar dengan Isolasi DNA Buffer Ekstraksi Isolasi DNA kasar

Isolasi DNA dengan Buffer Ekstraksi

Memecahkan dinding sel dan membrane sel lapisan pembungkusan DNA dengan menggunakan detergen dan garam dapur.

Memecahkan dinding sel dan membrane sel dengan detergen modifikasi CTAB dan mercaptoetanol

Tidak ada pemanasan pada proses ini.

Proses pemanasan pertama pertama bertujuan untuk melarutkan CTAB dan mercaptoetanol.

Tidak ada pengendapan komponen polisakarida

Kloroform dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan mengendapkan komponenpolisakarida di dalam buffer ekstraksi yang mengkontaminasilarutan DNA

Tidak ada penambahan buffer TE

Buffer TE berfungsi untuk melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak

Diambil larutan supernatan yang bercampur dengan kontaminan lainnya.

Supernatant yang diambil kontaminannya sangat sedikit

Ekstraksi DNA dengan kitchen preparation akan menghasilkan DNA kasar yang menggumpal dan belum murni (masih banyak zat lain yang terkandung)

Ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapa tmemisahkan DNA dari polisakarida Karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differentsial of solubility)

8

©FRONEXTON™‖Science One

3.2. TAHAPAN ISOLASI DNA DAN TUJUAN LANGKAH KERJA Dalam praktikum isolasi DNA menggunakan metode kasar (Kitchen Preparation ), langkah pertama yang kami lakukan adalah menyiapkan buah yang akan digunakan sebagai objek pengamatan ( strowberry, pisang, pepaya, tomat , sawi,dan kangkung ), setelah buah disiapkan, langkah selanjutnya adalah mengambil masing-masing 100 gr daging buah untuk dihaluskan menggunakan blender selama 40 detik, dan jangan lupa menambahkan aquades sebagai pelarut, agar buah mudah untuk dihancurkan dan diambil ekstraknya. Sementara itu, untuk mempersingkat waktu larutkan Detergen Rinso, attack, dan Bukrim, kedalam 60 ml aquades, diaduk perlahan selama 15 menit dan usahakan jangan sampai berbusa, hal ini bertujuan untuk mempermudah peroses pengamatan munculnya gelembung-gelembung DNA sekaligus untuk melisis sel pada buah. Deterjen yang sudah dilarutkan tadi kemudian masingmasing dicampur dalam 4 ml jus buah yang sudah diblender, sehingga ada 3 buah tabung raksi yang diamati dengan detergen yang berbeda-beda dalam setiap tabungnya. Kemudian Tambahkan 1 spatula garam dapur kedalam tiaptiap tabung reaksi dan diaduk selama 10 menit samapai diperoleh campuran yang homogen. Penambahan garam dapur bertujuan untuk memudahkan pemisahan benang-benang DNA dari larutan dan untuk mengendapkan kotorankotorannya sehingga benang-benang DNA tersebut akan mudah diamati. Langkah brikutnya adalah melakukan penyaringan hasil campuran pada point sebelumnya sebanyak 2 kali untuk memisahkan kotoran yang mengendap dengan sari buah. 6 ml hasil Penyringan pada tersebut kemudian ditambahkan 5 ml etanol 96% dingin. Etanol ini berfungsi untuk menggumpalkan DNA. Dan langkah akhir adalah melakukan pengamatan proses timbulnya benangbenang DNA, mulai dari warna, bentuk dan jumlah DNA yang dihasilakn.

9

©FRONEXTON™‖Science One

Berdasarkan Praktikum yang telah kami lakukan, diperoleh hasil sesuai pada tabel berikut :

10

©FRONEXTON™‖Science One

3.3. KEEFEKTIFAN DETERGEN DALAM PROSES ISOLASI DNA Dari hasil data yang diperoleh dalam praktikum yang telah dilakukan, dapat dijelasskan bahwa pada detergen yang bersifat cream mempunyai daya rusak paling rendah dalam merusak membran sel, sehingga DNA yang dihasilkan dalam proses pengamatan pun hanya terlihat sedikit, akibat memberan sel tidak dapat dirusak, sehingga DNA yang ada dalam ini sel pun menjadi tidak bisa diamati. Rata-rata dalam percobaan isolasi DNA dengan sabun bukrim, menunjukan gelembung-gelembung DNA yang dihasilkan berada dibagian bawah tabung reaksi. Pada Detergen bubuk ( Attck dan Rinso), memiliki daya rusak yang baik pada memberan sel, sehingga DNA juga tidak mengalami kerusakan, saat dikakukan pengamatan. Proses isolasi DNA dengan menggunakan detergen rinso dan attck menunjukan bahwa DNA hasil filtrasi rata-rata berada dibagian atas, dan warna hasil filtrasi pun tidak memiliki pengaruh dari detergen.

11

©FRONEXTON™‖Science One

Berdasarkan hasil literature didapatkan hasil bahwa antara detergen cair, bubuk, dan cream yang seharusnya mempunyai daya rusak paling tinggi dalam memecah membran sel adalah detergen cair. Karena di dalam detergen cair mengandung konsentrasi yang tinggi misalnya lauryl sulfat yang dapat berfungsi sama dengan dodesil sulfat dan disodium EDTA, serta kandungan zat pewarna dan zat aktif pemutih yang biasanya ada dalam detergen cair. Menurut Jamilah (2005: 95), detergen bubuk menghasilkan warna yang paling baik, yaitu putih, detergen krim memberikan warna yang kurang baik karena menyebabkan warna filtrat mendekati warna detergen, sehingga isolasi DNA yang dihasilkan berwarna sama atau hampir sama dengan filtrat. Ditinjau dari faktor penambahan garam ke dalam larutan detergen pada proses isolasi DNA, garam digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+ yang dikandung oleh garam mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif fosfat DNA, yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak mnolak satu sama lain sehinggga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA, DNA akan terkumpul (Dollard, 1994, dalam Jamilah, 2005: 21). Dari pernyataan tersebut, nampak bahwa selain digunakan untuk menghilangkan protein dan karbohidrat dan menjaga kesetabilan pH lysing buffer, garam juga membantu proses pemekatan DNA.Konsentrasi DNA yang terpresipitasi tergantung dari beberapa hal, antara lain: keenceran sumber DNA yang digunakan dan suhu ethanol. Semakin encer filtrat, maka DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. Sementara semakin dingin ethanol, DNA yang terpresipitasi semakin pekat. menambahkan bahwa semakin encer filtrat, maka DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit.

12

©FRONEXTON™‖Science One

BAB III PENUTUP 4.1.KESIMPULAN 

Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan merusak dinding dan membrane sel dan juga membrane inti. Perusakan ini dapat dilakukan dengan pemblenderan, penggerusan atau yang lainnya. Namun dalam



praktikum kali ini digunakan dengan cara pemblenderan DNA

dapat diisolasikan dari sumber DNA berupa buah dengan

penambahan

larutan

deterjen,

etanol serta garam untuk

membantu



presipitasi DNA.



pengamatan, pada masing- masing buah didapatkan hasil yang berbeda.

Hasil isolasi DNA sangat dipengaruhi oleh jenis buah. Terbukti dari hasil

Lapisan filtrasi buah selalu berada di bagian bawah karena filtrasi ini



cenderung untuk mengendap.



lebih ringan.



sangat ringan dan cenderung mengambang

Lapisan alcohol umumnya berada di bagian tengah karena masa jenisnya

Sedangkan lapisan DNA umumnya berada di bagian atas karena DNA

Detergen yang paling efektif digunakan dalam isolasi DNA adalah Rinso

4.2.SARAN o Seharusnya waktu yang disediakan untuk mengamati proses pemisahan DNA lebih lama agar DNA dapat lebih jelas terlihat o Dalam proses pengamatan usahakan untuk memanfaatkan waktu sebaik mungkin dalam kegiatan agar kerja lebih efektif

13...