LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA ISOLASI DNA DAN KUANTIFIKASI PADA BUAH BERRY (STRAWBERRY DAN BLUEBERRY) PDF

Preview

Summary

ISOLASI DAN KUANTIFIKASI DNA BUAH BERRY (STRAWBERRY DAN BLACKBERRY) diajukan untuk Memenuhi salah satu Tugas Mata Kuliah Praktikum Biokimia Dosen Pengampu: Dr. Heli Siti Halimatul M, M. Si Kelompok 2 Disusun oleh : Solihah (1700058) Anggota Kelompok : Shania Dewi Juliani (1700624) Yamni Yunita Hasan...

Description

ISOLASI DAN KUANTIFIKASI DNA BUAH BERRY (STRAWBERRY DAN BLACKBERRY)

diajukan untuk Memenuhi salah satu Tugas Mata Kuliah Praktikum Biokimia

Dosen Pengampu: Dr. Heli Siti Halimatul M, M. Si

Kelompok 2 Disusun oleh : Solihah (1700058) Anggota Kelompok : Shania Dewi Juliani (1700624) Yamni Yunita Hasan (1700628)

DEPARTEMEN PENDIDIKAN KIMIA FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA BANDUNG 2021

ISOLASI DNA PADA BERBAGAI MACAM BUAH BERRY A. Tujuan Praktikum 1.

Mengetahui cara/metode yang benar untuk memisahkan (mengisolasi) DNA dari buah strawberry dan blackberry

2.

Mengetahui pengaruh kandungan air yang terdapat pada suatu buah terhadap hasil isolasi DNA

3.

Mengetahui kemurnian dan menghitung konsentrasi DNA hasil isolasi dari buah strawberry dan blackberry

B. Dasar Teori 1. Pengertian DNA Deoxyribonucleic acid (DNA) isolasi adalah proses ekstraksi DNA dari berbagai sumber. Sumber untuk isolasi DNA sangat beragam. Pada dasarnya dapat diisolasi dari organisme hidup atau mati. Sumber-sumber umum untuk isolasi DNA meliputi seluruh darah, rambut, sperma, tulang, kuku, jaringan, noda darah, air liur, bukal (pipi) kapas, sel epitel, urin (Sadikin, 2002). Struktur DNA pertama kali diungkap oleh James Watson dan Franson Crick pada tahun 1953 berdasarkan atas foto difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Berdasarkan atas data yang diperoleh Watson dan Crick membuat struktrur DNA yang disebut untai ganda (double helix). Untai ganda DNA tersusun oleh dua rantai polinukleotida yang terpilin. Kedua rantai tersebut berikatan dengan adanya ikatan hidrogen antara basa adenin dengan timin sebanyak dua ikatan dan antara guanin dan sitosin sebanyak tiga ikatan (Triwibowo,2005 ).

Gambar 1. Struktur DNA double Helix DNA terdiri dari tiga macam molekul, yaitu gula pentosa, gugus fosfat dan basa nitrogen. Gula pentosa memiliki 5 atom C dan pada DNA. Gugus fosfat menyebabkan asam nukleat bermuatan negatif. Basa nitrogen yang menyusun asam nukleat ada dua macam, yaitu basa purin yang terdiri dari adenin dan guanin dan basa pirimidin yang terdiri dari timin dan sitosin. Basa purin atau pirimidin adalah basa nitrogen yang terikat pada atom C nomor 1 suatu molekul gula melalui ikatan N-glukosidik. Ikatan tersebut menghasilkan molekul yang disebut nukleosida. Nukleosida akan bergabung dengan fosfat dan membentuk molekul yang disebut nukleotida (Triwibowo, 2005). Asam nukleat berupa asam deoksiribonukleat, lebih dikenal dengan DNA (bahasa inggris : deoxyribonucleic acid), umumnya terletak di dalam inti sel. Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah materi genetik, artinya DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas sel. Ini berlaku umum bagi setiap organisme. DNA merupakan polimer yang terdiri dari tiga komponen utama, yaitu gugus fosfat, gula deoksiribisa, dan basa nitrogen. Sebuah unit monomer DNA yang terdiri dari ketiga komponen tersebut dinamakan nukleotida, sehingga DNA tergolong sebagai polinukleotida. Rangka utama untai DNA terdiri dari gugus fosfat dan gula yang berselangseling. Gula pada DNA adalah gula pentosa (berkarbon lima), yaitu 2deoksiribosa. Dua gugus gula terhubung dengan fosfat melalui ikatan fosfodiester antara atom karbon ketiga pada cincin satu gula dan atom karbon

kelima pada gula lainnya. Salah satu perbedaan utama DNA dan RNA adalah penyusunnya; gula RNA adalah ribosa. 2. Isolasi DNA DNA dapat diisolasi, baik dari sel manusia maupun sel tumbuhan. Teknik isolasi DNA sederhana memfasilitasi ekstraksi DNA total dari bahanbahan yang dikehendaki tanpa memerlukan bahan dan peralatan yang khusus dan cara pengerjaannya pun sangat sederhana. Dari teknik ini akan didapatkan DNA total dari seluruh bahan organik yang dipakai. DNA yang diperoleh bukanlah DNA murni, melainkan masih berupa kumpulan DNA yang bercampur dengan berbagai molekul sel yang lainnya, sehingga bisa diamati dengan mata telanjang atau dengan mikroskop sederhana. Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak. Metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA tergantung pada sumber, umur, dan ukuran sampel. Meskipun berbagai metode yang digunakan ada beberapa kesamaan di antara mereka. Secara umum, mereka bertujuan untuk menyajikan DNA terpisah dalam inti sel dari komponen seluler lainnya. Isolasi DNA biasanya dimulai dengan lisis atau rusaknya jaringan atau sel. Proses ini sangat penting untuk penghancuran struktur protein dan memungkinkan untuk pelepasan asam nukleat dari inti. Lisis dilakukan dalam larutan garam, deterjen yang mengandung protein denaturasi atau protease (enzim mencerna protein), seperti proteinase K. Hal ini mengakibatkan kerusakan sel dan melarutkan membran. Isolasi DNA adalah sebuah proses yang sederhana (Soewoto, 2000). Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik, yang digunakan untuk tujuan ilmiah, medis, atau forensik. Para ilmuwan menggunakan DNA di sejumlah aplikasi, seperti pengenalan DNA ke dalam sel dan binatang atau tanaman, atau untuk tujuan diagnostik. Dalam obat aplikasi yang terakhir

adalah yang paling umum. Di sisi lain, ilmu forensik perlu memulihkan DNA untuk identifikasi individu

(bagi

pemerkosa

misalnya,

pencuri

kecil,

kecelakaan, atau korban perang), penentuan ayah, dan pabrik atau identifikasi hewan (Sadikin, 2002). Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan dengan berhati-hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada DNA. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel baik dengan cara mekanik maupun cara kimiawi. Dengan cara mekanik dapat dilakukan melalui penggerusan atau pemblenderan dengan menggunakan mortal dan pistil, sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan menambahkan deterjen. Pada praktikum ini akan dilakukan isolasi DNA dengan metode sederhana dengan menggunakan sampel daging buah untuk mendapatkan DNA. 3. Blackberry

Sumber: www.google.com Blackberry merupakan buah yang dapat dimakan diproduksi oleh beberapa spesies dalam genus Rubus dari suku Rosaceae. Buah ini sebenarnya bukanlah merupakan berry, secara botani itu disebut buah agregat, terdiri dari drupelet kecil. Tanaman biasanya berumur dwitahunan dan akar tongkat abadi. Blackberry dan raspberry juga disebut caneberries atau semak berduri. Ini adalah kelompok besar, dan dikenal lebih dari 375

spesies, banyak yang berhubungan erat dengan mikrospesies apomiktis asli di seluruh belahan bumi utara iklim sedang dan Amerika Selatan. Blackberry terkenal karena bergizi tinggi mengandung serat pangan, vitamin C, vitamin K, asam folat, vitamin B, dan mineral esensial, mangan.

4. Strawberry 3.1 Tinjauan Tentang Strawberry Strawberry ialah tanaman buah herba yang ditemukan pertama kali di Chili, Amerika. Salah satu spesies tanaman strawberry yaitu Fragaria chiloensis L. Menyebar ke berbagai negara Amerika, Eropa dan Asia. Spesies lain, yaitu F.vesca L. lebih menyebar secara luas, jenis strawberry ini pula yang pertama kali masuk Ke Indonesia. Strawberry yang sering kita jumpai di pasar swalayan adalah hibrida Yang dihasilkan dari persilangan Fragaria virgiana L. Var Duchesne asal Amerika Utara dengan Fragaria Chiloensis L. Var Duchesne asal Chili. Persilangan itu Menghasilkan hibrida yang merupakan strawberry modern (komersil) Fragaria x Ananassavar Duchesne (Darwis, 2007).

3.2. Klasifikasi Strawberry

Gambar 2. 1 Fragaria x ananassa Kingdom

: Plantae

Subkingdom

: Tracheobionta

Superdivisi

: Spermatophyta

Divisi

: Magnoliophyta

Kelas

: Magnoliopsida

Subkelas

: Rosidae

Ordo

: Rosales

Famili

: Rosaceae

Genus

: Fragaria

Spesies

: Fragaria x ananassa (Rukmana, 1998).

3.3 Morfologi Strawberry Struktur tanaman strawberry pada akar terdiri atas pangkal akar, ujung akar, Batang akar, tudung akar, serta bulu akar. Tanaman strawberry mempunyai akar Tunggang yang terus tumbuh memanjang dan berukuran besar (Rukmana, 1998). Akar serabut dari tanaman strawberry tumbuh dangkal di dalam tanah dan Menyebar secara horizontal dengan panjang 30cm dan secara vertikal mampu mencapai kedalaman 40cm. Akar tersebut muncul dari batang yang pendek dan tebal yang berbentuk rumpun. Dari rumpun tersebut muncul tunas yang akan Menjadi crown baru, bunga dan sulur. Sulur merupakan batang ramping yang tumbuh keluar dari ketiak daun pada dasar rumpun dan menjalar sepanjang permukaan tanah. Sulur digunakan sebagai ‘alat’ untuk menghasilkan tanaman baru (Soemadi, 1997). Buah strawberry yang kita kenal sebenarnya adalah buah semu yaitu bukan Buah yang sebenarnya. Buah strawberry yang dikenal di masyarakat selama ini Merupakan reseptakel atau jaringan dasar bunga yang membesar. Buah yang Sebenarnya ialah biji-biji kecil dengan warna putih dan disebut dengan achen. Achen ini berasal dari sel kelamin betina yang telah diserbuki dan kemudian Berkembang menjadi buah kerdil. Achen kemudian menempel pada permukaan Reseptakel yang membesar (Setiani, 2007). Biji strawberry berukuran kecil, pada Setiap buah menghasilkan banyak biji. Biji dengan ukuran kecil ini terletak di antara daging buah. Pada skala penelitian tanaman biji merupakan alat perbanyakan Tanaman secara generative (Rukmana, 1998). 3.4 Kandungan Senyawa Kimia Strawberry Variabilitas dan kandungan pasti dari senyawa fenolik tertentu dari Strawberry bergantung pada banyak faktor, seperti kualitas genetik, kondisi Budidaya, tahap kematangan, waktu penyimpanan dan kondisi. Kandungan Polifenol seperti sianidin, pelargonidin, dan glikosida kuersetin lebih dikontrol.

Identifikasi fenolat pada makanan sangat penting karena sifat, ukuran, kelarutan, Derajat, dan posisi glikosilasi dan konjugasi, memiliki dampak pada penyerapan, Distribusi, dan metabolisme pada manusia (Sona et al, 2015). Strawberry biasanya dimakan dalam bentuk segar tapi sangat mudah rusak Dengan penurunan kualitas yang cepat akibat pembusukan yang cepat. Karena itu,bagian yang relevan dari strawberry diolah. Strawberry dikonsumsi dalam produk olahan seperti selai, jelli, pure, baik sebagai buah kaleng, atau sirup, dalam Minuman sebagai jus, dll. Sediaan strawberry yang baru diproduksi memiliki Kandungan TPC, antosianin, dan proantosianidin yang lebih tinggi, daripada yang disimpan selama enam bulan pada suhu 4 dan 30°C. Pengolahan jus menunjukkan banyak kehilangan semua fenolat (Sona et al, 2015). Antosianin pada strawberry adalah senyawa polifenol utama, yang Memberikan warna merah pada buah strawberry, dan dapat digunakan sebagai Pigmen alami (warna merah) untuk industri makanan. Kandungan antosianin Strawberry, dibandingkan dengan buah berry umum lainnya, jauh lebih rendah Daripada blueberry dan blackberry, dan lebih rendah dari pada raspberry. Karena dipengaruhi oleh seleksi kultivar, faktor lingkungan seperti cahaya, suhu, dan Metode pertanian. Tingkat degradasi antosianin juga tergantung pada waktu dan Suhu. Sejumlah antosianin strawberry meningkat menjadi rata-rata 4,3 kali lipat Setelah satu minggu penyimpanan. Disebabkan karena besarnya kenaikan suhu. Setelah penyimpanan pada 0°C, kandungan antosianin naik 1,7 kali lipat, Sedangkan pada penyimpanan 30°C, kenaikan yang jelas adalah 6,8 kali lipat. Produk strawberry, seperti pure yang disiapkan di bawah nitrogen atau karbon Dioksida, menghasilkan retensi antosianin lebih besar daripada yang disiapkan di Bawah udara. Dengan demikian, pengecualian oksigen yang dikontrol

selama

Pemrosesan

strawberry

tampaknya

mudah

untuk

memperbaiki stabilitas antosianin, namun beberapa kerugian dapat terjadi pada kondisi anaerobik selama penyimpanan. Faktor lain yang mempengaruhi

struktur warna dan antosianin adalah pH. Modifikasi pH dapat mempengaruhi reaksi kimia pada senyawa fenolik, seperti antosianin. PH rendah (2,5) lebih baik untuk pelestarian polifenol dalam produk strawberry selama penyimpanan beberapa bulan dari pada nilai yang lebih tiinggi, karena kandungan antosianin total berkorelasi dengan aktivitas antioksidan (Sona et al, 2015). 5.

Kuantifikasi (Penentuan Kemurnian DNA) Menggunakan Spektrofotometer UV dan Elektroforesis Gel Agarosa

1%. Penentuan kemurnian DNA menggunakan spektrofotometer UV, DNA hasil isolasi diukur pada panjang gelombang 260 nm, 280 nm dan 320 nm. Berdasarkan Sambrook dan Russel batas kemurnian DNA dalam analisis molekuler adalah 1,8 – 2,0 yang diperoleh dari rasio absorban A260/A280. Untuk mengetahui apakah ada kontaminan dari RNA selanjutnya DNA hasil isolasi dilakukan penentuan kualitas DNA dengan elektroforesis gel agarosa 1%. Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis) adalah pengukuran energi cahaya oleh suatu sistem kimia pada panjang gelombang tertentu (Day, 2002). Sinar ultraviolet (UV) mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, dan sinar tampak (visible) mempunyai panjang gelombang 400-750 nm. Pengukuran spektrofotometri menggunakan alat spektrofotometer yang melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometer UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif. Spektrum UV-Vis sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. (Rohman, 2007) Hukum Lambert-Beer menyatakan hubungan linieritas antara absorban dengan konsentrasi larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan. Dalam hukum Lambert-Beer tersebut ada beberapa pembatasan, yaitu :

– Sinar yang digunakan dianggap monokromatis – Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang yang sama – Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap yang lain dalam larutan tersebut – Tidak terjadi fluorensensi atau fosforisensi – Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan Hukum Lambert-Beer dinyatakan dalam rumus sbb : A = e.b.c dimana : A = absorban

b = tebal kuvet (cm)

e = absorptivitas molar

c = konsentrasi (Rohman, 2007)

PRINSIP KERJA Cahaya yang berasal dari lampu deuterium maupun wolfram yang bersifat polikromatis di teruskan melalui lensa menuju ke monokromator pada

spektrofotometer dan filter cahaya pada fotometer. Monokromator kemudian akan mengubah cahaya polikromatis menjadi cahaya monokromatis (tunggal). Berkas-berkas cahaya dengan panjang tertentu kemudian akan dilewatkan pada sampel yang mengandung suatu zat dalam konsentrasi tertentu. Oleh karena itu, terdapat cahaya yang diserap (diabsorbsi) dan ada pula yang dilewatkan. Cahaya yang dilewatkan ini kemudian di terima oleh detector. Detector kemudian akan menghitung cahaya yang diterima dan mengetahui cahaya yang diserap oleh sampel. Cahaya yang diserap sebanding dengan konsentrasi zat yang terkandung dalam sampel sehingga akan diketahui konsentrasi zat dalam sampel secara kuantitatif. (Rohman, 2007) C. Alat dan bahan ❖ Alat 1.

Saringan

2.

Sendok

3.

Gelas

4.

Wadah

5.

Kantong plastik

❖ Bahan 1.

Garam 1 sdt

7. Ammonium molibdat 5%

2.

Detejen 2 sdm

8. Larutan asam asetat 5%

3.

Air +/- 180 mL

9. Larutan CuSO4 5%

4.

Buah strawberry 10 buah

10.

Larutan NaHSO4 jenuh

5.

Buah blackberry 10 gram

11.

Reagen Bennedict

6.

HNO3 pekat

12.

Larutan Buffer TE

D. Langkah Kerja dan Pengamatan ❖ Langkah Kerja 1.

Membuat ekstrak buah ➢ Membersihkan buah. ➢ Memasukan buah ke dalam kantong plastik lalu melumatkan (menhancurkan) buah tersebut menggunakan tangan.

2.

Membuat larutan garam dan deterjen ➢ Menambahkan 150-180 mL aquades ke dalam gelas. ➢ Menambahkan cairan deterjen ke dalam gelas kimia 2 sendok makan, aduk perlahan sampai homogen. ➢ Menambahkan 1 sendok teh garam ke dalam larutan deterjen tadi, aduk kembali sampai garam larut dan didiamkan selama 20-30 menit. ➢ Menuangkan larutan garam dan deterjen ke dalam ekstrak buah dalam kantong plastik, aduk sampai homogen

3.

Mengektsrak DNA ➢ Menyaring campuran ekstrak buah+larutan garam+deterjen tadi ke dalam wadah yang baru dengan menggunakan saringan halus ➢ Menambahkan alkohol dingin secara perlahan ke dalam wadah. ➢ Menarik/mengambil massa putih yang terbentuk di dalam wadah setelah diberi etanol absolute dingin tadi. ➢ Mengamati hasil percobaan

❖ Pengamatan

Benang-benang putih diatas campuran merupakan DNA Strawberry

Proses presipitasi DNA buah blackberry

Hasil menyaring DNA strawberry 4.

DNA didiamkan setelah beberapa jam

Pemurnian hasil DNA ➢

Diambil hasil isolasi DNA

➢

Dilarutkan dalam Buffer TE pH 8

➢

Dimasukkan ke dalam kuvet

➢

Spektroskopi UV di set pada 260, 280, dan 320 nm

➢

Dicatat hasil data dalam ROD (Ratio Optical Density)

E. Analisis Data dan Perhitungan ❖ Data analisis Sampel DNA Strawberry

A260 1,577

Blackberry

1,410

A280 1,596 1,319

❖ Perhitungan 1.

Menghiutng Konsentrasi ng/φL = 10*50(A260-A320)

2.

-Strawberry

: 0,0551

-Blackberry

: 0,378

Menghitung Kemurnian (A260/A280 ratio) = (A260-A320)/(A280-A320) -Strawberry -Blackberry

: 1,51 ± 0,47

: 1,25 ± 0,97

A320 1,5219 1,032

F. Analisis dan Pembahasan 1. Analisis Pada praktikum kali ini, kita mempelajari cara yang tepat untuk melihat DNA suatu organisme dengan mengisolasinya dari lokasi awalnya, yaitu di Dalam nukleus. Dalam proses isolasi DNA, umumnya terdapat tiga tahapan Yang harus dilakukan oleh seorang peneliti, yaitu : 1. Melisis/menghancurkan sel dengan cara mekanik maupun kimiawi, karena Untuk mengekstraksi DNA, dinding sel(jika ada), membran sel, dan membran nukleus(pada eukariot) harus dihancurkan terlebih dahulu sehingga DNA dapat keluar dan terlihat massanya. 2. Purifikasi(pemurnian larutan). Ketika sel telah lisis, seluruh komponen sel akan bercampur satu sama lain. Sebagian besar proses manipulasi DNA mengharuskan agar DNA terpisah dan bebas dari protein dan RNA. Di Laboratorium, peneliti juga akan memperhatikan untuk menginaktivasi enzim Internal sel yang dapat mendegradasi/ menghancurkan DNA. Mereka kemungkinan menggunakan enzim pencerna protein, pemanasan, penambahan bahan kimia tertentu atau larutan organik seperti fenol untuk menonaktifkan enzim dan menghilangkan protein dari nukleus. Namun, kita Tidak melakukannya pada percobaan ini, karena kita tidak akan Menggunakan DNA yang diperoleh untuk tujuan eksperimen khusus. 3. Presipitasi, yaitu pemisahan DNA dari larutan, dengan cara Mencampurkannya dengan suatu bahan tidak dapat melarutkannya(DNA) Sehingga ia dapat memisah/terpresipitasi.( Anonim A, 2005) Sekarang mari kita analisis satu-persatu tahapan percobaan yang telah kita lakukan untuk mengetahui tujuan sebenarnya pelaksanaan seluruh tahapan dalam proses isolasi DNA ini.

1. Pemilihan bahan. Bahan yang digunakan dalam praktikum ini ialah irisan daging buah yang lunak, pemilihan buah dengan ...