ISOLASI DAN KUANTIFIKASI RNA PDF

Preview

Summary

Laporan Praktikum m.k Bioteknologi Akuakultur Laboratorium Reproduksi dan Genetika Ikan Departemen Budidaya Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor 2014 Isolasi dan Kuantifikasi RNA pada organ usus ikan betok (Anabas testudineus) dengan menggunakan metode Isogen/Genezo...

Description

Accelerat ing t he world's research.

ISOLASI DAN KUANTIFIKASI RNA Savni Retalia Sababalat

Related papers

Download a PDF Pack of t he best relat ed papers 

PENENT UAN RASIO KONSENT RASI RNA DAN DNA HOMOGENAT HAT I Nurul Marfira

SINT ESIS C-DNA Savni Ret alia Sababalat USULAN PENELIT IAN NONEKSPERIMENTAL Orin bondy

Laporan Praktikum m.k Bioteknologi Akuakultur Laboratorium Reproduksi dan Genetika Ikan Departemen Budidaya Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor 2014

Isolasi dan Kuantifikasi RNA pada organ usus ikan betok (Anabas testudineus) dengan menggunakan metode Isogen/Genezol Shinta Tiara N. (C14120012)1, Arini Arziani K. (C14120014)1, Nurfitriani Siti Y. (C14120017)1, Eka Aprilia W. (C14120022)1, Savni Retalia S. (C14120023)1, Deni Yunus W. (C14120032)1, Mohammad Sapta J. (C14120034)1, Adi Nur Huda (C14120036)1, Muhammad Alkahfi (C14134006)1 1

Departemen Budidaya Perairan, FPIK, IPB

ABSTRAK Isolasi asam nukleat adalah salah satu teknik yang dapat membuang dan memisahkan asam nukleat dari komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak, dll) sehingga asam nukleat yang diperoleh dapat dianalisis atau dimodifikasi lebih lanjut dengan teknik biologi molekular lainnya. Ada dua metode isolasi asam nukleat yaitu isolasi DNA dan RNA. Untuk mengisolasi mRNA eukariotik (yang hanya 2-5% dari RNA selular) dari campuran molekular RNA total dapat dilakukan dengan afinitas kromatografi terhadap kolumn oligo(dT)-selulosa. Isolasi RNA yang dilakukan menggunakan sampe MHC nila dengan metode gemzole mendapatkan hasil yang paling baik, yaitu dengan jumlah RNA yang mencapai mencapai nilai 145,66 dengan kemurnian RNA yang mencapai 94% dan rasio perbandingan protein sebesar 1,705. sehingga tingkat kemurnian yang tinggi 94%. MHC (Mayor Hystocompatibility Complex) merupakan molekul protein yang terdapat pada hampir semua permukaan sel-sel tubuh suatu organisme, maka dari itu kemungkinan konsentrasi RNA pada bahan yang digunakan yaitu MHC nila dengan gemzole memiliki jumlah RNA yang lebih tinggi dibandingkan dengan sampel yang lainnya. Kata kunci: Asam nukleat, DNA, Isolasi, MHC, Protein, RNA

Pendahuluan Ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah salah satu teknik dasar yang harus dikuasai dalam mempelajari teknik biologi molekular. Ekstraksi atau isolasi asam nukleat dapat membuang dan memisahkan asam nukleat dari komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak, dll) sehingga asam nukleat yang diperoleh dapat dianalisis atau dimodifikasi lebih lanjut dengan teknik biologi molekular lainnya. Ekstraksi asam nukleat ini berguna untuk meneliti bahan yang bersifat mikro dengan alat-alat yang bersifat mikro. Ada dua metode ekstraksi asam nukleat yaitu ekstraksi DNA dan RNA. Kedua metode tersebut hampir mirip dalam prosesnya, namun molekul RNA relatif pendek dan lebih sulit rusak dengan shearing sehingga disrupsi sel dapat dilakukan dengan lebih agresif. Meskipun molekul RNA relatif pendek, tetapi RNA sangat mudah didigesti oleh RNAse yang terdapat endogen dengan konsentrasi yang bervariasi di dalam sel dan di eksogen di jari. Sehingga, untuk ektraksi RNA harus menggunakan sarung tangan dan medium yang digunakan untuk isolasi harus mengandung detergen kuat untuk segera mendenaturasi RNAse yang ada. Proses deproteinisasi harus dilakukan secara lebih agresif karena RNA sering berikatan kuat dengan protein. Penambahan DNase dapat digunakan untuk menghilangkan DNA. RNA kemudian dipresipitasi dengan etanol. Reagen yang sering digunakan untuk ekstraksi RNA adalah guanidinium thiocyanate yang merupakan inhibitor kuat RNase dan merupakan denaturan protein. Integritas RNA dapat dicek

dengan elektroforesis menggunakan gel agarose. Spesies RNA yang terbanyak (molekul rRNA) berukuran 23S dan 16S untuk prokariot dan 18S dan 28S untuk eukariot. RNA tersebut akan tampak sebagai pita yang diskrit dalam gel agarose dan mengindikasikan RNA lainnya masih utuh. Proses ini biasanya dilakukan dalam keadaan denaturasi untuk mencegah terjadinya formasi struktur sekunder pada RNA (Brown et al 2009). Aktivitas nuklease selama proses ekstraksi asam nukleat dapat dikurangi dengan cara: Mempertahankan suhu inkubasi dan sentrifugasi di bawah suhu optimum nuklease (370C), misalnya dengan mempertahankan larutan ekstrak pada suhu es atau 40C. Menginaktivasi nuklease pada permukaan gelas, air dan bahan habis pakai dengan bahan kimia seperti DEPC (diethylpyrocarbonate). Selanjutnya inaktivasi dan atau penghambatan secara kimiawi, misalnya dengan fenol atau garam guanidinium. Penghilangan ion logam kofaktor untuk nuklease dengan chelating agent. Untuk mengisolasi mRNA eukariotik (yang hanya 2-5% dari RNA selular) dari campuran molekular RNA total dapat dilakukan dengan afinitas kromatografi terhadap kolumn oligo(dT)-selulosa. Pada konsentrasi garam yang tinggi, mRNA yang mengandung ekor poli(A) akan berikatan dengan molekul oligo(dT) komplementer pada kolumn afinitas, sehingga mRNA tetap tertinggal, sedangkan molekul RNA lainnya dapat dicuci bersih dari kolumn menggunakan larutan tinggi garam. Selanjutnya, mRNA

yang terikat tadi dapat dilarutkan dengan garam berkonsentrasi rendah (Theophilus 2008).

metode isogen sebesar 14,95 dengan kemurnian sebesar 69% dan rasio perbandingan dengan protein sebesar 1,251.

Material dan Prosedur Ikan uji yang digunakan pada praktikum isolasi RNA adalah ikan betok (Anabas testudineus). Organ yang digunakan untuk pengamatan isolasi RNA adalah bagian usus ikan betok. Alat yang digunakan yaitu mikrotube, mikropipet, vortex, sentrifuge, gene quant, grinder. Bahan yang digunakan yaitu organ usus ikan betok, isogen, kloroform, isopropanol, ethanol 70%, DEPC. Pertama yang dilakukan adalah mengambil organ usus ikan betok sebanyak 20 mg dan dimasukkan ke dalam tube yang sudah diisi dengan isogen 200µl. Lalu usus ikan betok di grinder menggunakan mikropestel sampai halus. Setelah halus, isogen ditambahkan sebanyak 600µl, lalu disimpan selama 5 menit dengan suhu ruangan. Setelah 5 menit, kloroform ditambahkan kedalam tube sebanyak 200µl, lalu di vortex selama 15 detik dan didiamkan selama 2-3 menit. Setelah itu sampel di sentrifuge (HR-1500FR) selama 5 menit dengan kecepatan 13000 rpm. Setelah itu supernatan yang terbentuk dipindahkan kedalam tube yang baru yang sudah berisi cairan isopropanol sebanyak 400µl, lalu sampel di vortex kembali dan dismpan dalam suhu ruanng selama 5-10 menit. Setelah itu, sampel di sentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan yang sama 13000 rpm, lalu supernatant dibuang. Setelah supernatant dibuang, lalu tambahkan cairan ETOH 70% atau ethanol dingin sebanyak 1 ml kedalam tube, lalu di sentrifuge selama 5 menit dengan suhu 4°C dan kecepatan 13000 rpm. Setelah itu buang supernatan, lalu keringkan di udara selama 15-30 menit. Setelah itu, larutan DEPC (Diethylpyrocarbonate) ditambahkan kedalam tube sebanyak 50µl, lalu di vortex. Setelah itu pengukuran sampel dengan menggunakan gene quant.

Hasil Berikut merupakan tabel hasil isolasi dan kuantifikasi RNA, Tabel 1 Hasil isolasi dan kuantifikasi RNA NO RNA PROTEIN RATIO PURITY (%) 1 46,40 0,1 1,368 76 2 30,62 0,1 1,431 79 3 41,93 0,1 1,368 77 4 14,95 0,1 1,251 69 5 23,67 0,1 1,697 94 6 55,17 0,1 1,488 82 7 46,62 0,1 1,447 80 8 83,84 0,2 1,482 82 9 21,45 0,1 1,321 72 10 145,66 0,4 1,705 94 Berdasarkan tabel diatas dapat diketahui bahwa sampel yang memiliki konsntrasi RNA paling besar adalah pada percobaan menggunakan sampel MHC nila dengan metode gemzole yang mencapai nilai 145,66 dengan kemurnian RNA yang mencapai 94% dan rasio perbandingan protein sebesar 1,705. Sedangkan sampel yang memiliki konsentrasi RNA paling kecil adalah pada percobaan menggunakan sampel usus ikan betook dengan

Pembahasan Asam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit mononukleotida, jika unit-unit pembangunnya deoksinukleotida maka asam nukleat itu disebut deoksiribonukleat (DNA) dan jika terdiri dari unit-unit mononukleotida disebut asam ribonukleat (RNA). DNA dan RNA mempunyai sejumlah sifat kimia dan fisika yang sama sebab antara unit-unit mononukleotida terdapat ikatan yang sama yaitu melalui jembatan fosfodiester antara posisi 3′ suatu mononukleotida dan posisi 5′ pada mononukleotida lainnya, Asam-asam nukleat seperti asam deoksiribosa nukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA) memberikan dasar kimia bagi pemindahan keterangan di dalam semua sel. Asam nukleat merupakan molekul makro yang memberi keterangan tiap asam nukleat mempunyai urutan nukleotida yang unik sama seperti urutan asam amino yang unik dari suatu protein tertentu karena asam nukleat merupakan rantai polimer yang tersusun dari satuan monomer yang disebut nukleotida. Dua tipe utama asam nukleat adalah asam deoksiribonukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA) (Fried dan George 2011). DNA adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di dalam inti sel. Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai materi genetik; artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas sel. Ini berlaku umum bagi setiap organisme. Di antara perkecualian yang menonjol adalah beberapa jenis virus (dan virus tidak termasuk organisme) seperti HIV (Human Immunodeficiency Virus). DNA terutama ditemui dalam inti sel, asam ini merupakan pengemban kode genetik dan dapat memproduksi atau mereplikasi dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru untuk memproduksi organisme itu dalam sebagian besar organisme, DNA suatu sel mengerahkan sintesis molekul RNA, satu tipe RNA, yaitu messenger RNA(mRNA), meninggalkan inti sel dan mengarahkan tiosintesis dari berbagai tipe protein dalam organisme itu sesuai dengan kode DNA-nya (Fried dan George 2011). Struktur dasar RNA mirip dengan DNA. RNA merupakan bahan genetik. Ia berfungsi sebagai penyimpan informasi genetik, sebagaimana DNA pada organisme hidup lain. Ketika virus ini menyerang sel hidup, RNA yang dibawanya masuk ke sitoplasma sel korban, yang kemudian ditranslasi oleh sel inang untuk menghasilkan virus-virus baru. Namun demikian, peran penting RNA terletak pada fungsinya sebagai perantara antara DNA dan protein dalam proses ekspresi genetik karena ini berlaku untuk semua organisme hidup. Dalam peran ini, RNA diproduksi sebagai salinan kode urutan basa nitrogen DNA dalam proses transkripsi. Kode urutan basa ini tersusun dalam bentuk ‘triplet’, tiga urutan basa N, yang dikenal dengan nama kodon. Setiap kodon berelasi dengan satu asam amino (atau kode untuk berhenti), monomer yang menyusun protein. RNA merupakan polimer yang tersusun dari sejumlah nukleotida. Setiap

nukleotida ,fmemiliki satu gugus fosfat, satu gugus gula ribosa, dan satu gugus basa nitrogen (basa N). Polimer tersusun dari ikatan berselang-seling antara gugus fosfat dari satu nukleotida dengan gugus gula ribosa dari nukleotida yang lain. Perbedaan RNA dengan DNA terletak pada satu gugus hidroksil tambahan pada cincin gula ribosa (sehingga dinamakan ribosa). Basa nitrogen pada RNA sama dengan DNA, kecuali basa timin pada DNA diganti dengan urasil pada RNA. Jadi tetap ada empat pilihan: adenin, guanin, sitosin, atau urasil untuk suatu nukleotida.Selain itu, bentuk konformasi RNA tidak berupa pilin ganda sebagaimana DNA, tetapi bervariasi sesuai dengan tipe dan fungsinya Menurut Sambrook dan Russel (2001) Penentuan kemurnian RNA berdasarkan ratio antara A260/A280. RNA dapat menyerap sinar ultraviolet pada panjang gelombang 260. Di dalam spektofotometer, sample dilewatkan pada panjang gelombang 260 dan panjang gelombang 280. Nisbah antara A260/A280 menentukan tingkat kemurnian dari RNA, terdapat hubungan linear positif antara kemurnian RNA dan nisbah A260/A280. Kemurnian RNA yang ideal didapatkan dari proses isolasi RNA adalah 95-100% dengan nisbah absorbansi sebesar 2.00±0.05, RNA dengan nilai nisbah A260/A280 sama dengan 2 memiliki tingkat kemurnian sebesar 100% Pada praktikum kali ini didapatkan kemurnian RNA terendah pada sample usus betok 69% dengan konsentrasi RNA 5,42 µg/ml hal ini dikarenakan sample mengandung kontaminan yang tinggi, proses pengerjaan yang tidak steril dan diduga pada sel-sel di jaringan usus materi genetik dari DNA tidak diekspresikan terlalu banyak sehingga RNA yang didapatkan pada organ ini sedikit dan tingkat kemurnian yang rendah. Hal ini berlawanan dengan sample MHC ikan sehingga memiliki tingkat kemurnian yang tinggi yaitu 94%. Kuantifikasi RNA menggunakan alat yang disebut Gene-Quant. Alat ini menggunakan prinsip spektofotometer, seberkas cahaya UV dilewatkan pada sampel dengan panjang gelombang tertentu untuk melihat kemurnian sampel tersebut. Kuantifikasi RNA umumnya mengukur purity, Konsentrasi protein, Konsentrasi RNA, dan Absorbansi. Purity merupakan tingkat kemurnian sampel RNA, Purity didaptkan dari hasil ratio absorbansi A260/A280. Tingkat kemurnian RNA berbanding lurus dengan nilai absorbansi dan berkolerasi positif, dimana nilai rasio absorbansi sama dengan 2 maka sample tidak terkontaminasi (Sambrook dan Russel 2001). Protein merupakan makromolekul yang terdiri dari beberapa asam amino yang telah memiliki fungsi tertentu. Pada proses isolasi RNA, protein adalah salah satu molekul yang menyebabkan RNA terkontaminasi sehingga protein harus dieleminasi pada sampel tersebut. Pengukuran konsentrasi protein menggunakan panjang gelombang 280. Konsentrasi RNA merupakan banyaknya RNA (µg) pada sample tersebut (mL), banyaknya RNA pada suatu sampel ditentukan oleh aktifitas organ sampel dan pengekspresian gen tertentu pada suatu organ,. Konsentrasi RNA diukur dengan panjang gelombang 260. Nilai absorbansi merupakan nilai yang diukur menggunakan panjang gelombang 260, sehingga nilai absorbansi merupakan acuan banyaknya konsentrasi RNA pada suatu sampel.

MHC (Mayor Hystocompatibility Complex) merupakan molekul protein yang terdapat pada hampir semua permukaan sel-sel tubuh suatu organisme, maka dari itu kemungkinan konsentrasi RNA pada bahan yang digunakan yaitu MHC nila dengan gemzole memiliki jumlah RNA yang lebih tinggi dibandingkan dengan sampel yang lainnya. Biasanya jumlah molekul MHC pada setiap sel sangat banyak, yang paling utama pada sel-sel limfoid. Jumlahnya dapat berkisar antara 10.000100.000 molekul setiap selnya. Dari hasil tabel yang di dapat konsentrasi RNA yang tinggi terdapat di kelompok 10 menggunakan bahan MHC pada ikan Nila dengan nilai konsentrasi yaitu 145,66 sedangkan nilai konsentrasi RNA yang terkecil ada pada usus ikan betok dengan nilai 14,95. Menurut Ji-cai Pang et al (2013) MHC yang paling tinggi terdapat dibagian perut ikan Nila hal tersebut dapat terjadi karena MHC merupakan wilayah genomik yang ditandai dengan polimorfisme yang sangat tinggi dan memiliki peran penting dalam respon imun. Bagian-bagian tubuh ikan yang memiliki MHC konsentrasi tinggi yaitu perut, insang dan usus sedangkan tingkat moderat dalam hati, ginjal, limpa dan hati lalu ekspresi yang rendah terdapat pada otak, otot dan kulit. Asam ribonukleat (RNA) merupakan senyawa yang berasal dari bahan genetik dan memiliki peran utama dalam ekspresi gen. Dalam dogma pokok (central dogma) genetika molekuler, RNA menjadi perantara antara informasi yang dibawa DNA dan ekspresi fenotip yang diwujudkan dalam bentuk protein. Asam ribonukleotida (RNA) adalah salah satu molekul asam nukleat yang dibentuk oleh asam dioksiribonukleotida (DNA) yang berfungsi untuk mensintesis protein di dalam inti sel. Molekul RNA merupakan polimer panjang yang tidak bercabang dari gugus ribonukleotida monofosfat yang digabungkan dengan ikatan fosfodiester. Untuk mendapatkan RNA pada organisme yang akan diamati dengan cara mengisolasi RNA dan untuk menghitung jumlah RNA dilakukan kuantifikasi RNA. Isolasi RNA merupakan teknik untuk memperoleh RNA yang diharapkan bebas dari kontaminan. Isolasi RNA dapat di manfaatkan untuk mengetahui laju pertumbuhan pada ikan, mendeteksi penyakit seperti virus, selain itu digunakan untuk ekspresi gen dan isolasi gen. Contoh dari isolasi RNA seperti dilakukannya kloning dan ekspresi gen pada ikan nila. Kloning merupakan proses pembuatan salinan dari suatu gen dengan prinsip teknologi DNA atau RNA. Molekul DNA atau RNA dibuat dengan menyisipkan fragmen yang mengandung gen target ke dalam vektor. Vektor berperan sebagai pembawa gen yang akan dikloning ke dalam sel insang. Dalam proses ini metode yang digunakan yaitu dengan di lakukannya isolasi DNA atau RNA, serta dilakukannya proses elektroforesis (Soekarno 2011). Contoh yang kedua yaitu mendeteksi virus pada ikan koi, metode yang digunakan dalam mendeteksi virus yang digunakan yaitu dengan isolasi DNA atau RNA, serta dilakukan proses PCR. Proses PCR dilakukan setelah isolasi DNA atau RNA, hasil dari isolasi tersebut dideteksi dengan menggunakan PCR, lalu visualisasi dengan elektroforesis (Mulyani et al 2011).

Kesimpulan Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa sampel yang memiliki kemurnian RNAyang paling baik adalah pada percobaan menggunakan sampe MHC nila dengan metode gemzole dengan jumlah RNA yang mencapai mencapai nilai 145,66 dengan kemurnian RNA yang mencapai 94% dan rasio perbandingan protein sebesar 1,705. sehingga tingkat kemurnian yang tinggi 94%. MHC (Mayor Hystocompatibility Complex) merupakan molekul protein yang terdapat pada hampir semua permukaan sel-sel tubuh suatu organisme, maka dari itu kemungkinan konsentrasi RNA pada bahan yang digunakan yaitu MHC nila dengan gemzole memiliki jumlah RNA yang lebih tinggi dibandingkan dengan sampel yang lainnya.

Daftar Pustaka Brown S M, Hay J G, Ostrer H. 2009. Essentials of Medical Genomics. New Jersey [USA]: Second ed. John Wiley & Sons, Inc. Chang S, Puryear J, Cairney J. 1993. A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees. Journal Plant Mol Biol Rep. 11(1993): 98 – 100. Fried G H, George J H. 2011. Schaums Tss Biologi Ed.2. Jakarta [ID]: Penerbit Erlangga. Ji-cai Pang et al. 2013. Major Histocompability complex class IIA and IIB genes of nile tilapia Oreochromis niloticus : Genomic structure, molecular polymorphism and expression patterns. Journal Fish & Shellfish Immunology. 34 (2013): 486-496. Sambrook J, Russel D W. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd edition. New York (USA) : Cold Spring Harbor Soekarno M T. 2011. Kloning dan ekspresi gen tilapia Growth Hormone (tiGH) untuk memproduksi protein rekombinan hormon pertumbuhan ikan nila (Oreochromis niloticus, Linnaeus 1758) [Skripsi]. Depok (ID): Universitas Indonesia. Theophilus B D M. 2008. Principles and Medical Applications of the Polymerase Chain Reaction. In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley, R. New Jersey [USA].Humana Press....