Spettroscopia - Riassunti concetti fondamentali medicina di laboratorio PDF

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Riassunti concetti fondamentali medicina di laboratorio...

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SPETTROSCOPIA (dal latino “spectrum” che vuol dire immagine) • Insieme delle tecniche spettroscopiche, attraverso le quali possiamo risalire alle proprietà strutturali dei corpi o delle molecole e studia l’interazione della materia con l’energia elettromagnetica • In biologia, studia struttura e dinamica delle molecole attraverso analisi loro interazione con la luce. • Possiamo effettuare analisi di tipo quantitativo e qualitativo • La luce puo’ essere descritta da lunghezza onda (λ) e frequenza (ν) → E= h ν (dove h è la costante di Plank=6,626176 x 10-34 ) • La conoscenza delle proprietà delle rad. elettromagnetiche e della loro interazione con la materia permette di conoscere i diversi tipi di spettri e diverse tecniche spettroscopiche Proprietà delle radiazioni elettromagnetiche • Forma di energia che può essere rappresentata da movimento ondulatorio → c = λ ν • La rad.elettromagnetica comprende una vasta gamma di frequenze che costituiscono lo spettro elettromagnetico che è costituito da diversi tipi di radiazioni, corrispondenti a diverse lunghezza d’onda (raggi γ, UV, x). Spettroscopia e proprietà della luce : interazione con la materia Gli elettroni, sia in atomi che in molecole, sono distribuiti su livelli energetici diversi, ma occupano soprattutto i livelli più bassi (stato fondamentale) • Un elettrone può passare ad un livello energetico superiore (stato eccitato), se al sistema è ceduta energia • Se l’energia deriva da una rad. Elettromagnetica, si avrà uno spettro di assorbimento. • Viene solo assorbita la quantità di energia equivalente alla differenza tra i livelli energetici E= E1-E2 = n.h.v. • Quando un elettrone da uno stato eccitato torna allo stato fondamentale il sistema emette 1 quanto di energia, dando origine ad uno spettro di emissione • Le frequenze della radiazione che può emettere un atomo di un elemento quando viene eccitato sono uniche per cui ogni elemento possiede uno spettro caratteristico formato da righe definite; quindi per ogni atomo sono possibili solo caratteristiche variazioni di energia • Lo studio delle radiazioni luminose assorbite, la determinazione dello spettro di assorbimento è un mezzo per la caratterizzazione ed identificazione di numerosi composti e cioè una valida metodica di analisi qualitativa

Tecniche spettroscopiche ❖ spettroscopia e spettroscopia di risonanza a raggi γ ❖ spettroscopia a raggi x ❖ spettroscopia nell’ultravioletto e nel visibile ❖ spettroscopia in dicroismo circolare ❖ spettroscopia atomica ❖ spettroscopia nell’infrarosso ❖ spettroscopia di risonanza di spin elettronico ❖ spettroscopia di risonanza magnetica nucleare

➢ Sono basate sullo scambio di energia che si verifica tra l'energia radiante (sotto forma di onde elettromagnetiche) e la materia. A seconda della tecnica distinguiamo: • Spettroscopia di emissione: valuta quella parte di energia emessa sotto forma di radiazioni elettromagnetiche • Spettroscopia di assorbimento: studia energia delle rad. elettromagnetiche che viene assorbita dalla materia. L' assorbimento di radiazioni di specifiche lunghezze d'onda da parte delle molecole è in grado di produrre transizioni energetiche degli elettroni esterni della molecola, sia impegnati che non in un legame. • Nb: la diagnostica del laboratorio utilizza tecniche elettroscopiche ad alta sensibilità, specificità, riproducibilità ed economicità • Distinguiamo spettroscopia rotazionale (onde radio), vibrazionale (infrarosso),molecolare elettronica (visibile e UV) , atomica (raggi x) Tecniche spettroscopiche utilizzate in diagnostica • Spettroscopia nell’ ultravioletto e nel visibile • Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare • Spettroscopia di emissione a raggi γ I raggi γ sono di origine nucleare, originano da transizioni che avvengono nel nucleo. Ha notevole effetto penetrante e trova applicazione nell’indagine medica e radioterapia. La radiazione emessa è rivelata dalla γ camera che studia forma e struttura del tessuto • Spettroscopia a raggi x I raggi x derivano dallo spostamento degli elettroni interni extra nucleari. Applicazioni: scienze forensi, studi di inquinamento ambientale e clinici per la misurazione della densimetria ossea (DEXA) • Spettroscopia atomica Utilizzata per laboratorio antidoping e tossicologici • Spettroscopia nell’ultravioletto e nel visibile Quando un raggio di luce bianca colpisce un prisma di vetro trasparente viene scomposto in tanti raggi di luce di diversi colori. (fenomeno dispersione del prisma) I componenti della luce bianca sono separati dal prisma in quanto le radiazioni diversa lunghezza d'onda mostrano diversa velocità nell’attraversare il vetro e l’acqua (come nel caso dell’arcobaleno). Risultano maggiormente deviate le radiazioni a più breve lunghezza d'onda (violetto) meno quelle a maggiore lunghezza d'onda (rosso) Tra le leggi che governano l'assorbimento della luce ricordiamo • Legge di Lambert – Beer Correla l'assorbimento della luce con il cammino ottico o lo spessore dello strato attraversato dalla luce (quindi è una relazione empirica che correla la quantità di luce assorbita da un materiale, alla concentrazione e allo spessore del materiale stesso attraversato). La spettrofotometria di assorbimento è interessata ai fenomeni di assorbimento delle radiazioni luminose della regione del visibile (350-700nm) e del vicino ultravioletto (200-350nm). Se definiamo: – i0 = intensità radiazione incidente, – ir = intensità radiazione riflessa, – ia = intensità radiazione assorbita, – it = intensità radiazione trasmessa, risulta che i0 = ir + ia + it

La legge di Lambert-Beer consente di calcolare la concentrazione (c) di una soluzione dalla misura dell’intensità della radiazione trasmessa IT quando sono noti l’intensità della luce incidente (I0), ed il cammino ottico (I): IT / I0 = 10 -ecl il parametro ‘e’ → coefficiente di estinzione molare e rappresenta la densità ottica di una soluzione in cui concentrazione e cammino ottico sono uguali ad 1 (c = 1, I = 1) Quando radiazione elettromagnetica attraversa una soluzione, una quota viene assorbita e la radiazione emergente avrà intensità più bassa. • Secondo la legge di Lambert-Beer l'assorbanza (A) è proporzionale sia alla concentrazione della sostanza assorbente, sia allo spessore dello strato attraversato, per cui, più elevata è la concentrazione delle molecole che passano dallo stato fondamentale a quello eccitato, maggiore sarà l’assorbanza (maggiore sarà la diminuzione dell’intensità del raggio incidente). • Ponendo a pari 100 volte il valore del segnale in assenza del campione, otteniamo la trasmittanza e da questa l’assorbanza. La calibrazione del valore zero (assorbanza nulla), viene effettuata utilizzando un campione costituito dal solo solvente (bianco). La trasmittanza (generalmente indicata con τ), in ottica e in spettroscopia, rappresenta la capacità di un materiale di lasciarsi attraversare da una parte della luce incidente. L'assorbanza (in passato densità ottica, indicata con D) è l'intensità di rad. elettromagnetica che viene assorbita da un corpo, in spettroscopia è definita come l'opposto del logaritmo della trasmittanza Lambert stabilisce che la luce assorbita risulta proporzionale allo spessore della soluzione. Beer studia assorbimento della luce in riferimento alla concentrazione della sostanza assorbente presente nella soluzione . Se si definisce l’assorbanza (e) come e = ε c l, questa risulta direttamente proporzionale alla concentrazione del soluto che sta assorbendo la luce. Trasmittanza è rapporto quale intensità della luce trasmessa dalla soluzione (i) e l’intensità della luce incidente (i0) per cui: t=i/i0 Il log decimale reciproco di t è l’assorbanza a per cui : a=log i0/i Aumenti lineari in concentrazione sono accompagnati da diminuzioni esponenziali della trasmittanza. Sorgenti di radiazioni per spettroscopia nel visibile ed ultravioletto • La sorgente di radiazioni è la parte dell'apparecchio da cui origina la radiazione policromatica, contenente tutte le λ del campo richiesto, che viene diretta sul campione. • Negli strumenti che misurano la luce visibile e l'ultravioletta, sono presenti 2 diverse lampade, in modo da coprire l'intervallo da 190 a 800 nm → Lampade adatte per la luce visibile, che coprono le λ comprese tra 350 - 800 nm (a filamento di tungsteno, lampade quarzo-iodio o lampade tungsteno-alogeno) → Lampade adatte per ultravioletto, che coprono le λ comprese tra 200 - 400 nm. Si usano lampade a scarica in un gas (deuterio o a idrogeno); • Gli spettrofotometri comuni hanno al loro interno queste due lampade, che vengono opportunamente selezionate dal meccanismo interno • Nella regione del visibile sono utilizzati i filtri colorati che assorbono tutta la luce meno un intervallo limitato di lunghezze d'onda, banda spettrale del filtro. • Colorimetro è composto da: lampada, filtro , cuvetta, rilevatore fotosensibile • Quando la lunghezza d'onda è selezionata utilizzando prismi e reticoli→ spettrofotometria Misura l'intervallo di lunghezze d'onda che una sorgente è in grado di produrre Prismi: dividono radiazione policromatica nei suoi componenti mediante fenomeno rifrazione Reticoli: ottengono lo stesso scopo mediante fenomeno diffrazione

SPETTROFOTOMETRO Strumento utilizzato in laboratorio per la misurazione della luce assorbita ed è costituito da: 1) sorgente di radiazione 2) selezionatore di lunghezze d’onda o monocromatore 3) cella 4) rivelatore 5) amplificatore e sistema di visualizzazione Gli spettrofotometri UV visibile si distinguono in : -sistemi monoraggio, si utilizzano per valutazioni quantitative -sistemi a doppio raggio, più accurati e usati per ottenere spettri di assorbimento ma anche per analisi quantitative • Il principale limite dei sistemi monoraggio risiede nel fatto che per ogni misura, si deve ripetere l'azzeramento contro il bianco. • Negli spettrofotometri a doppio raggio il sistema è doppio e invia due raggi, identici per frequenza ed intensità, uno attraverso il campione e l'altro attraverso il bianco, per cui si ha un confronto continuo tra l'assorbanza del campione e quella del bianco. Grazie a queste caratteristiche è possibile effettuare misure direttamente senza ripetere azzeramenti e a registrare continuativamente lo spettro di assorbimento Monocromatore Sistema ottico usato per disperdere la luce policromatica in bande monocromatiche che possono essere inviate separatamente sul campione. È costituito da : • un elemento disperdente (prisma o reticolo) che separa le varie componenti della radiazione • una fenditura che permette la successiva selezione della banda desiderata. Il fascio policromatico viene concentrato su un Prisma o un reticolo, che devia le diverse radiazioni con angoli diversi: il successivo passaggio attraverso la fenditura di uscita selezionerà radiazioni di λ centrata intorno ad un particolare valore. La larghezza della fenditura determina l’ampiezza del range di lunghezze d’onda: fenditure più strette risulteranno più selettive, ma lasceranno passare solo una piccola quantità della radiazione prodotta dalla sorgente. Cella La cuvetta, è un contenitore trasparente in cui viene inserito il campione, cioè la soluzione da esaminare. • La geometria della cellula determina il cammino ottico. • Vetro o plastica possono essere utilizzati per la luce visibile • Per le radiazioni UV si usano cuvette di quarzo, più trasparenti a quelle lunghezze d'onda Rilevatore Dispositivi che producono un segnale elettrico che dipende dall’energia della radiazione ricevuta. Il segnale elettrico, proporzionale all' intensità luminosa, viene amplificato e trasferito ad un indicatore. Esempi: • Fotoresistenze o fototubi, dispositivi che cambiano le caratteristiche elettriche in funzione della quantità di luce che li colpisce • Fotomoltiplicatori, che sfruttano l’effetto fotoelettrico amplificato • Fotodiodi, semiconduttori sensibili alla luce, che possono anche essere usati in serie di diodi per determinare lo spettro delle radiazioni.

Conclusioni La legge di Lambert-Beer consente di calcolare facilmente la concentrazione di una soluzione dalla misura dell’intensità della radiazione trasmessa quando sono noti l'intensità della luce incidente ed il cammino ottico. Grazie alla capacità da parte di sostanze di assorbire la luce a varie lunghezze d'onda e alla disponibilità di strumenti in grado di rilevarle, con l'applicazione di modelli matematici, si possono portare avanti sia studi qualitativi che quantitativi di qualsiasi sostanza vivente...