T.4, Mètodes d’estudi de les cèl·lules (I) PDF

Preview

Summary

Download T.4, Mètodes d’estudi de les cèl·lules (I) PDF

Description

T. 4

Mètodes d’estudi de les cèl·lules (I)

MICROSCÒPIA ÒPTICA INTRODUCCIÓ HISTÒRICA A L’ESTUDI DE LES CÈL·LULES Degut al petit tamany es necessiten tecnologies noves i instruments per al seu estudi. El objectiu es descobrir les formes en que s’utilitzen les diverses tècniques i presentar exemples dels tipus d’informació que es poden obtenir mitjançant aquestes tècniques. Microscopi: aparell d’augment que ens permeta veure allò que a simple vista no podem veure.



ROBERT HOOKE (1665)

- MICROSCOPI COMPOST (CÈL·LULES DEL SURO=CÈL·LULA) El 1665, Robert Hooke, al observar al microscopi, molt rudimentari en aquella època, un fragment de suro, descobreix que està composat per una sèrie d’estructures semblants a les cel·les dels panells de les abelles, per el que les va anomenar cèl·lules. En 1966 publicà el llibre Micrographía, el relat de 50 observacions microscòpiques i telescòpiques amb detallats dibuixos. Aquest llibre conté per primera vegada la paraula cèl·lula i en ell s’apunta una explicació plausible sobre els fòssils.



ANTON VAN LEEUWENHOEK (1674)

- MICROSCOPI SIMPLE (LUPA) Mentres desenvolupava el seu treball com comerciant de teles, va construir per a la observació de la qualitat de les teles LUPAS de millor qualitat que les que es podien aconseguir en aquell moment, després d’aprendre pel seu compte bufat i poliment de vidre. Va fixar petites LENTS biconvexes muntant-les sobre platines de llautó com les ulleres actuals. Va desenvolupar estructures en les quals es podien fixar tant la lent com l'objecte a observar.

Té dos lents: per on mirem i la que enfoca la mostra

El més potent dels seus instruments conservats avui en dia té una taxa d'ampliació de 275 vegades i un poder de resolució de 1,4 micres. No va deixar cap indicació sobre els seus mètodes de fabricació de les lents, i va haver d'esperar diverses dècades per disposar de nou d'aparells tan potents. S'ignora com il·luminava els objectes observats i la seva potència. Va construir instruments amb dos i amb tres lents. Va ser probablement la primera persona a observar bacteris i microorganismes.

 – –

MATHIAS SCHLEIDEN & THEODOR SCHWANN (1839) TEORIA CEL·LULAR: Tots els organismes estan compostos per cèl·lules La cèl·lula és la unitat estructural de la vida

 –

RUDOLF VIRCHOW (1855) COMPLETA LA TEORIA CEL·LULAR: Les cèl·lules només poden originar-se per divisió d’una cèl·lula preexistent

Molts dels principis de microscòpia que s’establiren anys enrere s’han mantingut impertèrrits fins avui dia. Però la microscòpia òptica prompte es quedà curta i l’avenç tecnològic possibilità l’aparició de la microscòpia electrònica. El microscopi ha servit per diferenciar la morfologia cel·lular (la forma d’una cèl·lula està adaptada a la seva funció).

CONCEPTES BÀSICS Resolució: és la capacitat de discriminar com entitats diferents dos punts molt junts. Quanta més resolució, més capacitat per a distingir. Límit de resolució (LR): mínima distància a la qual dos punts separats s'observen com unitats independents. Com mes petit sigui millor, perquè voldrà dir que estic veien estructures que entre elles hi ha una distancia molt petita. (Longitud d’ona)

(Apertura numérica)

Llum convencional: llum UV:

LR= 0,2 µm LR= 0,1µm

λ=500nm λ< 500nm

Augment o magnificació: incrementa el diàmetre de les estructures. És la resolució existent entre la grandària real de l’objecte i la imatge produïda pel microscopi.

𝑴𝒂𝒈𝒏𝒊𝒇𝒊𝒄𝒂𝒄𝒊ó =

𝑴𝒆𝒔𝒖𝒓𝒂 𝒅𝒆 𝒍′ 𝒐𝒃𝒋𝒆𝒄𝒕𝒆 𝒆𝒏 𝒍𝒂 𝒇𝒐𝒕𝒐 𝑴𝒆𝒔𝒖𝒓𝒂 𝒓𝒆𝒂𝒍 𝒅𝒆 𝒍′𝒐𝒃𝒋𝒆𝒄𝒕𝒆

Augment o magnificació útil: màxim augment d’un instrument òptic.

𝑴𝒂𝒈𝒏𝒊𝒇𝒊𝒄𝒂𝒄𝒊ó =

𝑷𝒐𝒅𝒆𝒓 𝒅𝒆 𝒓𝒆𝒔𝒐𝒍𝒖𝒄𝒊ó 𝒅𝒆 𝒍′ 𝒖𝒍𝒍 𝒉𝒖𝒎à 𝑷𝒐𝒅𝒆𝒓 𝒅𝒆 𝒓𝒆𝒔𝒐𝒍𝒖𝒄𝒊ó 𝒅𝒆𝒍 𝒔𝒊𝒔𝒕𝒆𝒎𝒂 𝒅𝒆 𝒍𝒆𝒏𝒕𝒔

Augment total del microscopi: es pot calcular multiplicant els augments que indica l’ocular pels dels objectius de major augment i de major grandària del microscopi.

Aug Augme me ment nt tota totall = A.Ocular · A.Màx. Obj. Magnificació enfront a resolució:

a)

La transició de (a) a (b) proporciona al observador una major magnificació i resolució. La transició de (b) a (c) només produeix una major magnificació (magnificació buida). La qualitat de la imatge es deteriora conforme la magnificació buida augmenta. Obertura numèrica: la llum s’enfoca en la mostra mitjançant la lent condensadora i es recull en la lent del objectiu del microscopi. L’obertura numèrica està determinada per l’angle del con de la llum que entra en l’objectiu de la lent (α) i per l’índex de refracció del medi (n) [aigua o oli] entre la lent i la mostra. Expressa el diàmetre del feix lluminós que pot recollir l'objectiu (n • senα).

1,515

Diàmetre de la part de la preparació que se està veient en cada moment

76x26mm

ESTRUCTURA DE LA LUPA BINOCULAR PART MECÀNICA I PART ÒPTICA molt semblants a les del microscopi. Més simple, però amb la mateixa forma de funcionar. Els augments que tenen les lupes amb les que treballareu són:  Objectius: 2x i 4x  Oculars: 10x Els avantatges de la lupa binocular sobre el microscopi òptic són, principalment, que no es necessita una manipulació prèvia de la mostra i que el gruix d’aquesta no és un factor limitant.

Camp brillant: el con de llum es veu com un fons brillant contra el qual la imatge de l'espècimen cal contrastar. Ideal per a mostres d'alt contrast.

Estereoscòpic: s'utilitza per oferir una imatge estereoscòpica (3D) de la mostra. Aquest tipus de microscopis permet que la distància entre la mostra i l'objectiu pugui anar des d'un parell de centímetres a desenes d'ells. → S’utilitza en cirurgia Ideal per observar objectes de grandàries relativament grans, de manera que no és necessari processar les mostres ni tampoc que la llum passi a través seu.

Invertit: són aquells en què el cos, objectiu i ocular es troben localitzats sota la platina, mentre que l'espècimen és il·luminat des de dalt. Ideal per observar organismes o teixits en cultiu sense una preparació prèvia.

Camp fosc: és un microscopi òptic el sistema condensador ha estat modificat per dirigir la llum a la preparació des dels costats, de manera que només la llum difractada per la preparació passa a l'ocular i es fa visible. A causa d'aquesta disposició, la mostra en el preparat apareix il·luminada sobre un fons fosc. Ideal per a l'observació en estat viu de partícules i cèl·lules que d'altra manera estarien per sota dels límits de resolució del microscopi òptic.

Contracti de fases: Converteix les diferències d'índex de refracció en diferències d'intensitat, brillantor i foscor, que són visibles a l'ull humà. Ideal per a observació de mostres vives.

Contracti d'interferència diferencial: permet obtenir informació sobre la densitat òptica de la mostra i observar detalls que d'ordinari són invisibles. Els objectes es veuen foscos o clars en un fons gris, de manera semblant a les imatges del microscopi de contrast de fases, però sense halos de difracció. Dóna com a resultat una imatge de l'espècimen en 3D o relleus que corresponen a les variacions de la densitat òptica de la mostra amb èmfasi en línies i vores, com si la cèl·lula projectés ombres cap a un costat. Ideal per a l'estudi de cèl·lules vives, no acolorides, espècimens una mica gruixuts que no permeten l'ús de contrast de fases i per a tractaments de fertilització in-vitro.

Microscopi de llum ultraviolada: utilitza com radiació la llum ultraviolada que, en tenir una longitud d'ona menor que la llum visible, proporciona un poder de resolució de fins a 0,1 micròmetres. Precisa lents de quars i la il·luminació per llums de mercuri. La mostra no es pot observar directament a través de l'ocular perquè la llum ultraviolada pot danyar la retina. La imatge es mostra amb fosforescència, en fotografia o amb un escàner electrònic. Ideal per detectar àcids nucleics, o proteïnes que contenen determinats aminoàcids. Mitjançant longituds d'ones específiques per a la il·luminació es pot obtenir mesuraments espectrofotomètriques per quantificar el DNA i el RNA de cada cèl·lula.

Fluorescència: permet observar la localització de determinats compostos (fluorocroms o fluoròfors) que absorbeixen radiació UV invisible i emeten porcions d'energia en longituds d'ona visibles i més llargues (fenomen que es coneix com fluorescència). Ideal per marcatge de molècules i teixits per a la seva caracterització i identificació.

Microscopi confocal: microscopi òptic que incorpora dues diafragmes: un diafragma d'il·luminació, generalment de mida invariable i localitzat després de la font lluminosa, i un diafragma de detecció, de mida variable situat davant del fotodetector. La utilitat d'aquest diafragma de detecció és eliminar la llum provinent de plans superiors i inferiors al pla focal, augmentant amb això la claredat i resolució de la imatge. Produeix una imatge d'un pla prim situat dins d'un espècimen molt més gruixut. Ideal per seguir processos dinàmics i capturar la seqüències d'imatges en vídeo en cèl·lules vives.

Observació d’imatges en els diferents microscòpics

Micrografies òptiques d'un protist ciliat tal com s'observa en un camp brillant (a), amb contrast de fase (b) i amb òptica de contrast per interferència diferencial (c).

Microscopi de fluorescència Ús de variants de GFP per seguir les interaccions dinàmiques entre neurones i les seves cèl·lules blanc in vivo (a) Porció de cervell d'un ratolí amb dos neurones fluorescents de colors diferents. Els ratolins s'obtenen mitjançant l'aparellament d'animals transgènics les neurones es marquen amb una o altra proteïna fluorescent. (b) Micrografia amb fluorescència de porcions de dues neurones, una marcada amb YFP i una altra marcada amb CFP.

MICROSCOPI ÒPTIC

Parts del microscopi

L’objectiu 60X no és habitual, però la AN està molt propera a la unitat. Això s’aconsegueix fent objectius llargs i formats per 20 lents com a mínim

Objectiu 100X, és l’únic on s’utilitza l’oli d’immersió

ESTRUCTURA DEL MICROSCOPI ÒPTIC PART MECÀNICA Peu: sobre el que descansa el microscopi. Acostuma a portar una llum incorporada de baix voltatge, que pot ser fixa o variable. En els microscopis més senzills existeix un mirall mòbil que s’orienta cap a la llum fins aconseguir que la preparació quedi il·luminada. Aquest mirall té dues cares. Una cara plana que s’utilitza quan la llum és la d’una llum (llàntia) propera i una cara còncava per la llum neutral. Platina: superfície on es col·loca la preparació. Per fixar-la s’utilitzen unes pinces. En alguns casos la platina porta incorporat un “carro mòbil” que ens permet desplaçar la preparació en els dos eixos de coordenades. Normalment conté una escala per conèixer quina part de la preparació s’està observant. Tub ocular: es troba dins de l’ocular i el revòlver portaobjectius. Pot tenir longitud variable i aquesta pot aparèixer gravada a nivell de les anotacions de l’objectiu. La longitud més utilitzada és de 170mm. Constitueix el suport dels oculars i objectius. Revòlver portaobjectius: dispositiu al que, per un sistema de rosca van adossats els diferents objectius. Si està ben construït proporciona parafocalitat (els objectius tenen tots la mateixa distància des de la rosca fins la mostra, de manera que al passar d’un a l’altre, no toquen la platina i la imatge està pràcticament enfocada, si ho estava amb el primer objectiu utilitzat). Cargol macromètric i micromètric: s’utilitzen per enfocar la preparació. El macromètric serveix per realitzar el primer enfocament i el micromètric per acabar de corregir-lo. Cargol macromètric: serveix per obtenir un primer enfocament a l’utilitzar-se l’objectiu de menor augment. Desplaça la platina verticalment de forma perceptible. Cargol micromètric: serveix per obtenir un enfocament precís de la mostra un cop s’ha realitzat l’enfocament primari amb el macromètric. També desplaça verticalment la platina però pràcticament de forma imperceptible. És l’únic cargol d’enfocament que s’utilitzarà en canviar a objectius de major augment un cop realitzat el primer enfocament.

PART ÒPTICA Ocular: sistema de lents situat a l’extrem superior del tub ocular. La senyal gravada, per exemple a 10x, indica l’augment de l’ocular. Aquesta dada multiplicada per l’augment de l’objectiu amb el que s’està treballant, ens indica l’augment amb el que estem observant la mostra. Depenent de si hi ha un o dos oculars, els microscopis són mono- o binoculars, respectivament. Objectius: estan formats per un sistema de lents, el seu nombre varia depenent de l’augment i de la qualitat de l’objectiu. Els seus augments varien des de 3.2x (panoràmica), 10x, 25x, 40x, a 90x o a 100x (immersió). La utilització d’aquest últim comporta l’addició d’un oli especial (oli d’immersió) sobre la preparació. L’oli d’immersió té un índex de refracció semblant al del cristall, que fa que el nombre de raigs refractats per la mostra que penetren a l’objectiu sigui major, per tant, ens ofereix una major obertura numèrica i en conseqüència un major poder de resolució. Els objectius de 90 i 100x porten una indicació característica que correspon a la presència d’un cercle negre o l’anotació oil. L’objectiu proporciona una imatge real, invertida i ampliada de la preparació que observem. L’ocular actua com un microscopi simple (lupa) que rep la imatge de l’objectiu projectada entre el focus principal i la lent superior. El resultat que s’obté de l’acció dels dos és una imatge real, invertida i amplificada de l'objecte. En microcirurgia es treballa amb microscopis estereoscòpics formant la imatge per reflexió i evitant que aquesta s’invertisca (el límit de resolució és escàs). Condensador: sistema de lents que concentra la llum sobre la preparació. Pot ser fixa o mòbil. En cas de ser mòbil, per augments petits, la posició ha de ser generalment baixa, però a majors augments ha d’apropar-se a la preparació, degut a la necessitat d’obtenir més llum. El sistema d’il·luminació consta d’una font lluminosa, els seus raigs són concentrats i dirigits pel condensador cap a la preparació. La quantitat de llum que arriba es regula obrint i tancant el diafragma i pujant o baixant el condensador, en el cas que aquest sigui mòbil. Diafragma o iris : sistema de làmines plegables que regula, amb el seu tancament o la seva obertura, la quantitat de llum que arriba a la preparació. Transformador: ja que el voltatge de la bombeta és menor al de la xarxa elèctrica, és necessari subministrar el voltatge adequat. Alguns microscopis el porten incorporats al peu. A més a més, el transformador té un potenciòmetre per regular la intensitat de la llum. L’augment és la resolució existent entre la grandària real de l’objecte i la imatge produïda pel microscopi. L’augment total del microscopi es pot calcular multiplicant els augments que indica l’ocular pel dels objectius de major augment i de major grandària del microscopi.

Formació de la imatge 

Dos conjunts de rajos entren en el objectiu:

1. - Els que no modifica l'espècimen que correspon a la llum que prové del condensador que passa de manera directa a la lent de l'objectiu i constitueix la llum de fons. 2. - Els que altera l'espècimen i que la lent de l'objectiu enfoca per formar una imatge real i magnificada de l'objecte  

Els raigs de llum de la mostra (2) s'enfoquen a la retina, mentre que els raigs del fons (1) estan fora de focus, de manera que es produeix un camp brillant difús. El PR d'una lent d'objectiu és proporcional al sinus de α. Les lents amb major poder de resolució tenen longituds focals més curtes, el que significa que la mostra quan s'enfoca se situa més a prop de la lent d'objectiu.

L'objecte es col·loca a una distància de l'objectiu una mica més gran que la focal, produint-se la imatge real, invertida i amplificada entre l'ocular i el seu focus anterior. El ocular, que actua com una lupa observa aquesta imatge i produeix una altra, virtual, invertida i encara més ampliada.

Limitacions de les mostres biològiques per a la seva observació amb el microscopi òptic A) GRUIX: realització de talls, (0,10 – 0,15 µm), després d’un previ tractat de la mostra. Excepcions: Cèl·lules sanguínies Extensions bacterianes Frotis testicle/ovari, estudi de l’esperma (espermograma) Cultius cel·lulars

Consisteix en analitzar aspectes físics del semen com: el volum, pH, aparença i consistència; aspectes cel·lulars de l'espermatozoide en relació amb el nombre, mobilitat i morfologia, i la presència d'altres cèl·lules com leucòcits o eritròcits.

B) CONTRAST: Observació amb microscopis òptics especials que juguen amb la llum per colorar la mostra. Tincions amb colorants vitals (preparacions temporals): → Per a cèl·lules vives Ex. Blau de Metilè, Vermell neutre, Verd Janus... Tincions amb diferents colorants (preparacions permanents): Ex: Hematoxilina-Eosina…

Tinció Hematoxilina-Eosina Quan es tenyeix una cèl·lula el nucli queda lila per la hematoxilina, i la resta com a mes rosa per la eosina. La naturalesa de l’hematoxilina és bàsic i tenyeix el nucli ja que és àcid, i la de la eosina és àcida que tenyeix el citoplasma que és bàsic.

Extensió sanguínia:

Fixador (alcohol) Colorant àcid Colorant bàsic

Els eritròcits no tenen nucli i quan es tenyeixen la zona del centre queda més clara a causa de la seva forma

Per fer una mostra d'extensió bacteriana: En un portaobjectes s'escalfen una mica els bacteris. Utilització de la tinció de Gram: els bacteris que admeten la tinció de Gram apareixen al microscopi de color violeta clar i s’anomenen grampositius. Els que no admeten la tinció de Gram apareixen al microscopi de color morat fosc i s’anomenen gramnegatius.

Tipus de mostres VIVES: preparacions temporals. Solament haurem de corregir la limitació del contrast, perquè seran cèl·lules individuals. Ex.: Control de cultius cel·lulars, estudi de l’esperma etc. 1. Muntatge simple Porta/Cobre. 2. Utilització de M.O. especials (més avant els veurem). 3. Contrast amb colorants vitals: blau de metilé, solució de Lugol, índigocarmí, blau d’ Evans, etc. MORTES: preparacions permanents. Solen sorgir complicacions. Cèl·lules aïllades: fixació, tinció, muntatge. Òrgans (biòpsies): 1. FIXACIÓ: consisteix en l’estabilització dels components de principals de la mostra mitjançant substàncies químiques com el formol 6% o el sèrum fisiològic. 2. (Deshidratació) INCLUSIÓ: endurirem la mostra amb parafina, però abans deshidratarem la mostra perquè la parafina és hidròfoba. Per deshidratar-la la clavarem en diferents dissolucions alcohòliques, cada vegada més concentrades, per aprofitar l’efecte osmòtic dels medis hipertònics sense destruir la mostra.

3. MICROTOMIA = TALL 4. (Rehidratació) TINCIÓ. Eliminem la parafina per poder tenyir amb colorants aquosos (en una estufa, la parafina es dissol i l’alcohol es volatilitza). Rehidratem la mostra introduint alcohol cada vegada menys concentrat, paulatinament, perquè la cèl·lula és sensible a canvis osmòtics, fins arribar a l’aigua. Realitzem la tinció. 5. (Deshidratació) i MUNTATGE. Tornem a deshidratar la mostra d’alcohol poc concentrat a alcohol pur per muntar el cobre. Entre el cobre i el porta clavarem una substància apegalosa amb un índex de refracció d’1,515 (igual que el cobre, l’oli d’immersió i el porta), amb l’objectiu de fixar el porta sense perdre qualitat de visió. Importància de matar les cèl·lules en el moment just (metafase) en el cas de l’estudi de Cromosomes = Cariotip

TÈCNIQUES DE PREPARACIÓ DE MOSTRES

La parafina es hidròfoba i la mostra es hidròfila perquè té formol.

Es va canviant la concentració d’alcohol fins que s’arriba a l’absolut.

Per endurir el teixit MICROTOMIA

Rehidratació: va al inrevés de la deshidratació

Deshidratació. Muntar amb el cubre

(mi...