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Professeur: Courtade Saidi...

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TECHNIQUES HISTOLOGIQUES Introduction : L’histologie consiste en l’observation et l’interprétation de structures visibles plus particulièrement à l’échelon microscopique. Dans cette démarche, 4 étapes vont se succéder : 1. le choix du matériel à étudier! 2. la technique permettant de visualiser les structures ou les phénomènes que l’on veut étudier 3. la production d’images de ces structures ou de ces phénomènes, par des moyens optiques! 4. l’interprétation de ces images. L’observation au microscope permet d’ameliorer le pouvoir séparateur de l’œil : L’oeil humain normal est capable de voir 2 points séparés de 200 mm Le pouvoir séparateur du microscope optique (M O ) est 1000 fois plus soit : 200 nm ou 0,2 mm Le pouvoir séparateur du microscope électronique (M E ) : 0,2 nm Le choix du matériel et les modalités de prélèvement : Les méthodes utilisées en histologie varient selon le matériel à étudier et les objectifs de l’examen (diagnostic histopathologique chez l’homme ou chez l’animal, ou protocole de recherche) On distingue l’étude des cellules isolées (prélèvements cytologiques) et celle de coupes de tissus ou d’organes voire d’organismes entiers comme par exemple des embryons de souris (prélèvements tissulaires ou histologiques). En pratique médicale, divers types de prélèvements nécessitant un examen microscopique peuvent être obtenus à partir d’un organisme. 1- Prélèvements tissulaires : Le matériel est prélevé de différentes façons. Il peut être obtenu par biopsie

(fragment d’organe obtenu de façon directe comme pour la peau, le muscle, ou guidée par endoscopie pour les organes des appareils respiratoire, digestif, urinaire..),

ou peut provenir d’une pièce opératoire, d’une autopsie . La préparation de ce matériel tissulaire fait appel aux techniques dites d’Histologie. 2 - Prélèvements cytologiques : Des cellules entières peuvent être examinées sur des frottis (étalement de cellules sur une lame de verre recueillies soit par ponction (par exemple l’étude des cellules sanguines, études des cellules médullaires hématopoïétiques) soit par frottement d’une muqueuse (par exemple l’étude du frottis cervico-utérin). La technique de ponction à l’aiguille permet de recueillir divers liquides de l’organisme (liquide céphalo-rachidien, liquide d’épanchement des séreuses pleurales, péricardiques, péritonéales, liquides articulaires) et permet de réaliser des prélèvements d’organes divers (ganglion lymphatique, sein, thyroïde, rein, foie ....). Enfin des liquides spontanément émis par l’organisme tels que l’urine peuvent être recueillis. La préparation de tous ces différents types de matériel fait appel aux techniques dites de Cytologie

Techniques de MO : Les coupes examinées sont le fruit de procédures techniques qui se déroulent en plusieurs

étapes successives : - fixation -inclusion - coupe - coloration - montage 1-Fixation Elle est indispensable quelle que soit la nature du prélèvement et la technique utilisée par la suite. Les examens histologiques sont en règle réalisés après traitement du matériel par des agents physiques ou chimiques (fixateurs) qui tuent les cellules mais visent à préserver au maximum leurs caractéristiques morphologiques et biochimiques. On peut ainsi considérer que les structures cellulaires sont figées dans un état qui est le plus proche possible de celui qu’elles présentent à l’état vivant. La fixation entraîne ainsi une immobilisation des cellules et des tissus, une inhibition de l’autolyse (enzymes lysosomiales) et de la putréfaction des tissus, un durcissement (variable selon les fixateurs) et une modification du volume des tissus. Elle doit se faire immédiatement après le prélèvement méthodes : - immersion dans un grand volume de liquide fixateur pour une durée variable selon le volume du prélèvement , au moins 10 fois plus que le volume du prélèvement formaldéhyde ou formol Alcools : éthanol Liquide de BOUIN (solution aqueuse de formol, d’acide acétique et d’acide picrique). - congélation! à – 20°C - dessication : séchage à l’air après étalement, particulièrement adaptée pour la cytologie sanguine (frottis sanguins) - Un examen macroscopique ("recoupe") des pièces opératoires une fois fixées permet d’effectuer des prélèvements systématiques ainsi qu’orientés par les éventuelles lésions observées. 2 - Inclusion Il s’agit ensuite de durcir le prélèvement qui sera ainsi plus facile à couper en tranches

minces (5 à 7 μm d’épaisseur). Le principe consiste à imprégner les tissus fixés par de la paraffine dont les propriétés sont les suivantes : absence d’affinités chimiques, point de fusion à 56° C – solide à 20° C, non miscible à l’eau, hydrophobe non miscible aux alcools, soluble dans le xylène . Ces propriétés impliquent de respecter différentes étapes avant l’inclusion en paraffine.

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Déshydratation

Avant l’inclusion en paraffine, il est nécessaire de déshydrater les échantillons puisque cette dernière n’est pas miscible à l’eau. En pratique les échantillons sont placés dans différents bains d’alcool de concentration croissante (50°, 70°, 90°, 100°) afin d’assurer une déshydratation complète. Passage dans le solvant de la paraffine : "Les échantillons déshydratés sont placés dans des bains de solvant de la paraffine (Xylène par exemple) de façon à permettre une imprégnation homogène.

! 3 - Inclusion A la sortie du bain de xylène l’échantillon est immergé plusieurs heures dans de la paraffine liquide (à 56° C). Une fois bien imprégné de paraffine il est ensuite coulé dans un bloc de paraffine qu’on laisse durcir à température ambiante. 4 – coupe : Les blocs de paraffine contenant l’échantillon sont débités en tranches de 5 à 7 μm

d’épaisseur à l’aide d’un microtome muni d’un rasoir en acier. Les coupes obtenues sont ensuite étalées et collées à l’aide d’albumine glycérinée sur une lame de verre. 5 - Coloration L’œil humain peut déceler les variations de longueur d’onde (couleur) et d’intensité de la lumière visible. La majorité des constituants de la cellule sont transparents dans la région visible du spectre lumineux. Le peu d’absorption de la lumière par la cellule vivante est en grande partie dû à son contenu élevé en eau et les constituants de la cellule montrent très peu de variations de transparence ou de contraste. Il est possible de pallier à cet inconvénient en utilisant des colorants qui se fixeront de façon sélective sur les divers constituants cellulaires. Les variations de coloration produisent alors le contraste. La plupart des colorants existent sous forme de sels qui, en solution aqueuse, peuvent être chargés positivement (colorants basiques) ou négativement (colorants acides). Les affinités tinctoriales des composants cellulaires sont en relation avec cette charge. On doit respecter différentes étapes avant la coloration : - déparaffinage par la chaleur et des bains de xylène - réhydratation des coupes : bains d’alcool de concentration decroissante - colorations : Les colorations de routine utilisent le plus souvent l'Hémalum-éosine La coloration du Trichrome de Masson La coloration à l’orcéine pour les fibres élastiques deux familles de colorants : - Les groupements acides des acides nucléiques réagissent avec les colorants basiques tels que !l’hémalun, l’hématoxyline, le bleu de toluidine ... Ainsi les noyaux sont dits "basophiles".--> couleur bleue violacée - Les composants basiques des protéines cytoplasmiques réagissent avec les colorants acides comme l’éosine, la fuschine acide ... Ainsi les constituants du cytoplasme sont dits "acidophiles ! à฀ couleur rose orangée

coloration à l’hémalun-eosine

!La coloration à l'Hémalum-éosine associe l’hémalun qui colore les noyaux en bleu violet et l’éosine qui colore le cytoplasme en rose. Les fibres de collagène sont également visibles

en rose. .! La ! coloration du Trichrome de Masson associe un colorant nucléaire (hématoxyline), un colorant cytoplasmique et un colorant des fibres de collagène (Bleu d’Aniline). Ainsi par le Trichrome de Masson, les noyaux sont colorés en violet, le cytoplasme en rose et les fibres de collagène en bleu vif. Cette coloration est particulièrement bien adaptée lorsque l'on veut mettre en évidence les fibres de collagène - colorations spéciales : Elles permettent de mettre en évidence de façon éléctive : - les fibres élastiques : orcéine à฀ brun : fuschine résorcine à฀ rose-fuschia

- les fibres de reticuline : imprégnation argentique à฀brun

La ! capacité pour une molécule colorante de donner à certaines structures tissulaires une teinte différente de celle de la solution colorante est appelée métachromasie et on donne au colorant correspondant le nom de colorant métachromatique. Par exemple le Bleu de Toluidine, solution bleue, a la capacité de colorer les substances contenant des mucopolysaccharides acides (mucus acide, substance fondamentale du cartilage) en rose fuschia, il s'agit d'un phénomène de métachromasie. En revanche, une structure colorée en bleu par le Bleu de Toluidine sera qualifiée d'orthochromatique.

6 - Montage ! : La coupe ou les cellules après coloration sont protégées par une lamelle de verre collée à l'aide d'une résine qui polymérise à température ambiante (Baume du Canada ou EUKITT) dont les propriétés sont les mêmes que celles de la paraffine. Il sera donc nécessaire de déshydrater la préparation (alcools de concentration croissante) et de la tremper dans un bain de solvant de type xylène. !

Techniques spéciales : 1- histochimiques : Mise en évidence des Polysaccharides par la réaction du P.A.S. Le « Periodic Acid Schiff » (PAS) est une réaction qui permet la détection des polysaccharides comme le glycogène et des mucopolysaccharides ou glycosaminoglycanes formant le mucus. L'oxydation par un bain d'acide périodique ( HIO4) coupe les radicaux a-glycol des molécules d'oses et génère des fonctions aldéhydes. Le réactif de Schiff en présence des fonctions aldéhydes produit un précipité rose fuschia Exemples : mise en évidence du glycogène dans les hépatocytes, du mucus dans les cellules caliciformes de l’épithélium respiratoire, intestinal et dans les cellules muqueuses de l’épithelium de surface gastrique.

- Mise en évidence des lipides

Les graisses sont dissoutes par les solvants habituellement utilisés en histologie courante (alcools, xylène ou toluène). Afin de conserver les lipides dans un tissu, il est nécessaire de réaliser des coupes sur du tissu congelé (à l'aide d'un cryostat). Il est alors possible de visualiser les lipides grâce à des colorants électifs, comme les Soudans par exemple (Rouge ou Noir Soudan). Une légère fixation par le formol avant congélation peut éventuellement améliorer la conservation et donc l'observation du reste du tissu.

2 - Immunohistochimie – Immunocytochimie L'immunohistochimie permet l'identification de molécules spécifiques ou antigènes par l'intermédiaire d'anticorps spécifiques dont la fixation sera révélée par un marqueur de nature variable. Il peut s'agir de molécules fluorescentes ou de microparticules colorantes issues d'une activité

Microscopie électronique en transmission (M.E.T.) !

Le principe demeure le même que celui de la microscopie optique mais avec des contraintes différentes. Le faisceau lumineux est remplacé par un faisceau d'électrons. Comme pour la microscopie photonique, les tissus à étudier au microscope électronique doivent être fixés, enrobés et coupés, bien que les étapes soient différentes. !1 – Fixation : ! La fixation du tissu est beaucoup plus critique que pour la microscopie photonique parce que les coupes sont soumises à un examen beaucoup plus approfondi. Pour arriver à la fixation la plus rapide et donc à l’altération la plus faible des cellules, on prépare de très petits fragments de tissu dont la taille ne doit pas 3 excéder le mm . Dans le but de préserver les détails ultrastructuraux cellulaires, une

double fixation est réalisée. On utilise le plus souvent une solution tamponnée de Glutaraldéhyde pour la première partie de la fixation, suivie d’une deuxième fixation ou post-fixation dans du Tetroxyde d'Osmium (OsO4 ou acide osmique) en solution tamponnée. L’osmium est un métal lourd réagissant principalement avec les acides gras et permet ainsi de préserver les membranes. La durée de la fixation est adaptée à chaque tissu. La fixation est réalisée à basse température (4°C) afin d'éviter les phénomènes d'autolyse qui se produisent à température ambiante. Il est important de noter que les mélanges fixateurs de la microscopie optique sont inutilisables. ! 2 – Inclusion : Les milieux d'inclusion sont des résines acryliques (époxy ) de plus grande dureté que la paraffine et surtout d'une plus grande résistance, elles permettent de réaliser des coupes ultrafines.!Leurs propriétés sont comparables à celles de la paraffine (non miscible à l'eau, non miscible aux alcools, miscible à l'oxyde propylène) Les échantillons sont déshydratés par passages dans des bains d'alcool de concentration croissante puis plongés dans un bain d'oxyde de propylène avant l'enrobage en résine ou époxy (gélule). 3 – Coupe On utilise un ultra microtome muni d'un rasoir constitué par un éclat de verre ou de diamant. L'épaisseur des coupes ultrafines est de l'ordre de 50 nm (100 fois plus fines qu'en microscopie optique). Les coupes sont recueillies à la surface d’un petit réservoir d’eau puis déposées sur une grille métallique, seul support permettant à la fois l'observation et le passage des électrons.

4 – «Coloration » On utilise des sels de métaux lourds qui se déposent sur certaines structures et leur donnent ainsi la densité atomique nécessaire pour diffracter le faisceau d’électrons, créant ainsi des contrastes au sein du tissu. Il ne s'agit pas d'une véritable "coloration" mais d'une augmentation de l'opacité aux électrons. Les coupes sont traitées directement sans qu'il soit nécessaire d'éliminer la résine ou de réhydrater. Les "colorants" les plus utilisés sont l'acétate d'uranyle (contrastant les nucléoprotéines : noyau, nucléole, ribosomes) et le citrate de plomb (contrastant les membranes : organites cytoplasmiques et membrane plasmique). En coloration négative : la suspension de sels de métaux lourds est déposée autour des structures à observer (par exemple les particules virales et les fibres de collagène qui n'ont pas d'affinités pour ces colorants) et permet de visualiser les contours et les irrégularités de surface. Ainsi l’échantillon biologique apparaît plus clair que ce qui l’entoure, d’où le terme de coloration négative.

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