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Tema 4: replicación del material genético y enzimas de replicación Modelos de replicación del DNA Modelo semiconservativo: La replicación del DNA es semiconservativa. Cada molécula hija (cadena de nueva síntesis) tiene una cadena de la molécula madre (cadena molde). Modelo aceptado. Los modelos que se barajaban antes de este descubrimiento eran: Conservativo: a partir de la molécula de DNA vieja se obtenían dos cadenas de DNA nuevas más dos cadenas de la vieja. Dispersivo: a partir de la molécula original se iban a sintetizar dos moléculas formadas por fragmentos de DNA antiguos y nuevos.

Ciclo celular El ciclo celular comprende de diferentes fases: - Fase G1: célula crece. Se puede mantener en estado estacionario (G0 = cel. no se divide) o dirigirse hacia la mitosis. Los puntos de control son aquellos puntos que si la célula los pasa, ya está obligada a pasar a la siguiente fase. Control G1/S. - Fase S: S de síntesis. Fase de duplicación del DNA. - Fase G2: la célula entra en fase de preparación para la mitosis. Una vez pasado el punto de control G2/M entra en fase de mitosis. - Fase M: mitosis. Repartición equitativa del material genético. - Citocinesis: división de la célula.

Replicación del DNA en procariotas La replicación comienza en una secuencia de nucleótidos en el ADN llamada origen de la replicación (oriC). Esta secuencia es distinta según la especie, pero tiene abundante T y A. En la iniciación de la replicación intervienen las siguientes proteínas: 

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Helicasas: son enzimas que reconocen la secuencia de nucleótidos oriC y rompen los puentes de hidrogeno entre las bases nitrogenadas complementarias. Se encargan de abrir la doble hélice para que las cadenas puedan servir de molde para las nuevas cadenas. Topoisomerasas: el desenrollamiento de la doble hélice da lugar a tensiones entre las dos cadenas; las topoisomerasas se encargan de hacer cortes en las cadenas para liberar tensiones de superenrollamiento. Cortan una (las topoisomerasas I) o las dos cadenas (las topoisomerasas II) de DNA. Proteínas SSB: son las proteínas estabilizadoras que se unen a cada cadena de ADN separada por la helicasa para que no vuelvan a unirse. Así permiten el paso correcto de la ADN polimerasa.

Una helicasa actúa en cada sentido, por lo que este proceso es bidireccional. Las dos horquillas de replicación que se han creado forman las burbujas u ojos de replicación. Como la ADN-polimerasa necesita tener un cebador al que poder añadir los nucleótidos, tiene que intervenir primero una ARN-polimerasa que sintetice un pequeño fragmento que sirva como cebador. A esta ARN-polimerasa se le llama primasa, y al fragmento de ARN que sirve como cebador primer. Dado que la síntesis de DNA por las DNA-polimerasas procede siempre en dirección 5’ a 3’, solo la hebra de ADN que va en dirección 3’ a 5’ es copiada de manera continua (cadena continua). La otra hebra que va de 5’ a 3’, es copiada de manera discontinua y se conoce con el nombre de cadena discontinua o retardada. La síntesis discontinua de la cadena rezagada produce pequeños fragmentos de DNA llamados fragmentos de Okazaki formados por la DNA-polimerasa III. Después la DNA-polimerasa I elimina los cebadores y, mas tarde, rellena los huecos que ocupaban los RNA por ADN. Por último, la DNA-ligasa, une con un enlace fosfodiéster los diferentes fragmentos de Okazaki.

Estructuras replicativas Modelo del circulo rodante: manera de replicarse de algunos plasmidios bacterianos. Se produce el corte de una cadena por una nucleasa, quedara un extremo libre OH que actuara de cebador. Actúa como un carrete de hilo (cadena continua). Una vez tengamos un trozo de monocadena, empieza la replicación de esta cadena discontinua. El ultimo enlace fosfodiéster lo hará una ligasa. Replicación del DNA mitocondrial: dos modelos a) Modelo de lazos o modelo de desplazamiento de cadena (modelo clasico): una de las cadenas de DNA es una cadena pesada (por su composición en bases) y hay otra cadena ligera. El origen de replicación de cada cadena es diferente. Hay dos orígenes, 1 OriH primero se activa este origen de replicación, se separan las cadenas de DNA i empezara la replicación. Cuando esta cadena avanza en la replicación llega un momento que sobrepasa el otro origen de replicación y este se activara (OriL). No hay fragmentos de Okazaki.

b) Modelo de Ritols: modelo más reciente. Presenta dos opciones:  Lo que se sintetiza es una cadena de copia de DNA y otra de RNA, que evita que se quede una cadena de DNA no protegida. Después, este RNA se va substituyendo por DNA.  No se sintetiza completamente una cadena de RNA complementaria de la de DNA, sino que se van formando pequeñas estructuras de RNA que luego son sustituidas.

Replicación cromosomas de eucariotas La replicación de DNA se realiza con distintos orígenes de replicación. La velocidad de replicación es más baja en eucariotas que en procariotas. Cada origen de replicación de llaman replicones. En cada horquilla de replicación el procedimiento general es el mismo que en procariotas. Etapas de la replicación en eucariotas: 1) Iniciación: es la puesta en marcha de todas las enzimas que se necesitan para replicar el DNA eucariota. o Complejo de reconocimiento del origen (ORC) o Factor permisivo de replicación. o Inicio de la replicación. 2) Elongación: inicia la síntesis de la cadena continua y discontinua (Polimerasa δ), síntesis (polimerasa α) y eliminación de cebadores y unión de los fragmentos de Okazaki (ligasa). 3) Terminación: formación de los telómeros i el ensamblaje de los nucleosomas.

Iniciación Complejo de replicación (ORC) El replicator es la zona que dará lugar a el inicio de replicación. Son reconocidos por proteínas por unas secuencias especificas ricas en TA. El complejo de origen de replicación (ORC) son las primeras en unirse. Reclutara otras dos proteínas CDC6 i CDT1. Luego se une las helicasas Mcm2-7, Que es una helicasa formada por dos subunidades. Todo esto es el preRC Este no se activa inmediatamente, están inactivos. Factor permisivo de la replicación Para que la replicación se active depende de la concentración de unas kinasas dependientes de ciclinas. Cuando la cantidad de estas proteínas es baja se formarán preRC pero no se activan (esto ocurre en la fase G1 del ciclo celular). En la fase S augmenta la concentración de kinasas dependientes de ciclinas, llamadas CDK. Entonces ocurre que las kinasas fosforilan las proteínas CDC6 I CDT1 i promueve su degradación. Algunos autores consideran que las CDK son las que fosforilan las helicasas, que las activan. Las polimerasas se unen, tenemos la polimerasa delta, épsilon, alfa (ultima en unirse).

Elongación A partir de aquí comienza la fase de elongación. Es cuando se empieza a sintetizar la nueva cadena de DNA. El primer lo sintetizara la DNA-polimerasa α. Primero actúa como la primasa para sintetizar el primer, después sufre un cambio de conformación i se activa su forma de DNA-polimerasa, sintetizando los primeros nucleótidos de DNA. Esta es rápidamente substituida por la polimerasa épsilon i delta (equivalente a polimerasa III). La DNA-polimerasa α es relevada porque la procesividad (velocidad) de esta es muy baja. La función de la polimerasa delta siempre ha sido indiscutible, pero la épsilon no esta tan claro (se sabe que trabaja de manera colimerante con la delta). Algunos autores consideran que tiene mayor relevancia con las funciones de reparación del DNA. La α delta i la épsilon dependen de una proteína (abrazadera deslizante). La abrazadera deslizante tiene forma de c al revés, esta hace como una argolla, se une al DNA y ayuda al deslizamiento y la procesividad. Depende de otra proteína (con forma de e al revés) es el cargador de abrazadera. El cargador de abrazadera es dependiente de ATP. Es necesaria para la alta velocidad de las polimerasas. La polimerasa α no tiene capacidad de eliminar el cebador, lo hace la RNAsaH o la enzima FEN-1. Los eucariotas tienen varios orígenes de replicación en ambas direcciones simultáneamente. Cuando se activan unos orígenes se inhibe la formación de otros. El número de orígenes y el momento de activación esta predeterminado. Hay replicones que inician la replicación de manera activa i otros pasiva. Cuando se inicia un replicón inhibe que se formen nuevos. Los de manera activa son aquellos que se replican sin que dependan de la proximidad de una horquilla de replicación. Suelen ser lo que sean zonas con alta actividad génica. Los de manera pasiva son los que se encuentran en medio de dos replicones activos, por la proximidad de las horquillas de replicación. Suelen ser los que se encuentren en zonas de heterocromatina.

Terminación de la replicación Cromosomas circulares procariotas: no presentan problemas porque la estructura termina cuando las dos uniones han recorrido totalmente la molécula. Cromosomas de eucariotas: dificultad para completar el ultimo fragmento de Okazaki por falta de grupo OH libre. Para completarlo se elimina el fragmento y queda una cadena mas larga que la otra.

Proceso de formación de los telómeros En las células somáticas los telómeros se van acortando. En cambio, en las germinales actúa la telomerasa, una enzima que se encarga de alargar los telómeros. Es una enzima muy estudiada. La telomerasa esta formada por dos partes: una secuencia pequeña de RNA y una proteína. Su actividad es parecida a una transcriptasa inversa. Utiliza como molde su propio RNA para copiar este RNA en DNA en la cadena. Por lo tanto, un telómero tiene siempre la misma composición de nucleótidos de DNA (los correspondientes al RNA de la telomerasa). La telomerasa actúa como cebados: una polimerasa celular se une a la telomerasa y finaliza la síntesis de la segunda cadena de DNA complementaria.

Bucle en T de los telómeros Los telómeros forman una monocadena. Esto hace que los extremos de los cromosomas se plieguen (bucle en T). Las proteínas TRF2 facilitan la formación del bucle. Es por lo tanto una de las enzimas que controla la acción de las telomerasas. Las TRF1 median para que el final de la monocadena se inserte en la doble cadena de DNA, rompiendo los puentes de H y permitiendo así la preservación de las monocadenas, evitando que sean hidrolizadas.

Resumen de las diferencias entre la replicación del DNA en eucariotas con procariotas -

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Velocidad menor Multiples orígenes Rondas no solapadas Fragmentos de Okazaki más cortos Polimerasas distintas:  Delta y épsilon: la hebra continua y discontinua  Alfa: síntesis de cebadores  Beta: reparación DNA  Gamma: replica DNA mitocondrial Control más complejo Existencia de telómeros

Los nucleosomas y la horquilla de replicación Cuando pasa la horquilla de replicación los nucleosomas se desorganizan: las histonas se desprenden de la estructura nucleosómica, manteniendo unidos los tetrámeros H3 y H4 y por otro lado los dímeros H2A y H2B. Cuando pasa la horquilla de replicación los cromosomas se vuelven a ensamblar i las histonas viejas se reparten de manera aleatorio en una u otra cadena de DNA. De manera que un nucleosoma puede estar compuesto por histonas viejas o nuevas. Tenemos una repartición aleatoria, se llama la herencia distributiva de las histonas durante el proceso de replicación. En la cromatina encontramos los aisladores, que son secuencias específicas del DNA que actúan de barrera para que no se metilen las histonas.??? Los nucleosomas tienen una histona especial (histona CenPA) característica a las histonas próximas al centrómero (zonas muy compactadas) suele substituir a la H3. En regiones promotoras de genes tenemos una histona H2AZ....