Transduction - Cours de microbiologie, par J.Radom. Niveau 2e année de licence BBCP, semestre PDF

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Cours de microbiologie, par J.Radom.
Niveau 2e année de licence BBCP, semestre 4....

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La transduction En 1951, LEDERBERG et ZINDER travaillant sur Salmonella typhimurium, montrent que des caractères génétiques peuvent être transmis d’une bactérie à une autre par l’intermédiaire d’un agent présent dans le milieu de culture. En 1952, ils démontrent que l’agent responsable de ce transfert est un bactériophage P22. Le transfert de matériel génétique réalisé par un bactériophage = Transduction. Ce transfert peut intéresser l’ensemble des marqueurs génétiques = transduction généralisée Si c’est un nombre restreint de marqueur = transduction spécialisée.

La transduction généralisée Mise en évidence LEDERBERG et ZINDER (1951)

Deux souches de Salmonella typhimurium :  Une souche auxotrophe pour l’histidine  Une souche auxotrophe pour le tryptophane Culture d’une colonie de la souche histidine moins et tryptophane moins dans un milieu nutritif pendant plusieurs heures, puis étalement sur un milieu minimum  Présence de colonies sur ce milieu MM, (1/100000000). Bactéries prototrophes Mélange d’une colonie de chaque bactérie auxotrophe, incubation dans un milieu nutritif pendant plusieurs heures, et étalement sur un milieu MM.  Présence de colonie sur MM (1/100000) Il y a eu échange de matériel génétique entre les deux souches. Comment s’effectue cet échange entre les deux souches de bactéries ? 

Expérience de Bernard DAVIS    

Une suspension d’une souche bactérienne incapable de croître sur un milieu MM est introduite dans une branche du tube en U. Une suspension d’une souche incapable de synthétiser d’autres métabolites essentiels est introduite dans l’autre branche. Le liquide peut passer d’une branche à l’autre si l’on applique une pression mais les bactéries ne peuvent pas traverser le filtre séparant les deux branches. Après plusieurs incubations, les cellules sont étalées.

 Présence de colonies sur le milieu MM Conclusion :

  

Ce transfert ne dépend pas d’un contact entre les deux bactéries Ce processus de transfert n’est pas analogue à la conjugaison Echange de matériel génétique par l’intermédiaire d’un phage (P22)

En 1955, LENNOX a isolé un bactériophage (P1) qui se comporte comme P22 de Salmonella Typhimurium. A partir de 1955, la transduction de E.coli par le bactériophage P1 est devenu une technique obligatoire pour l’étude de E.coli. Schéma expérimental pour la transduction par le bactériophage P1 chez E.coli. a) Préparation du lysat ou du stock P1 b) Transduction Fréquence des particules transductrices Si on prend un gène donné, la fréquence est 1/100 000. La fréquence totale des particules transductrices est de 0,3%. Origine des particules transductrices Expérience d’IKEDA et TOMIZAWA (1965)

Utilisation d’une souche de bactérie thymine moins. (BrU) BrH Infection Fond du tube et haut du tube On mesure l’absorbance le long du tube (à 260). On a des phages virulents et des phages transducteurs. Un pic noir + un pic vert en a, au même endroit. Cela permet de dire que les 2 types de phages sont aussi denses l’un que l’autre (ADN de même densité donc de même taille). Il y a coupure des L’origine de l’ADN des particules transductives En b, culture en présence de thymine, on a des phages virulents et des phages transducteurs. Densité des virulentes inchangées et densité des transductrice plus lourde. Transduction généralisée par les bactériophages a) Le bactériophage se fixe sur la membrane externe de la bactérie b) Le phage injecte son ADN dans la bactérie c) Circulation de l’ADN du bactériophage (présence d’extrémités homologues) d) Réplication de l’Adn du bactériophage selon le modèle du cercle tournant (formation de long concaténaire linéaire double brin) e) Début de la synthèse des protéines de la tête et de la queue du bactériophage. f) Encapsidation de l’Adn du phage à partir de séquences spécifiques g) Parfois, l’encapsidation se fait par erreur sur l’ADN de la bactérie ; production d’un bactériophage contenant une partie du génome de la bactérie (bactériophage transducteur) h) Le développement des phages entraîne la lyse de la bactérie i) L’ensemble de ce processus conduit à l’apparition d’une population mixte de bactériophage : P1 virulents et P1 transducteurs.

Application de la transduction généralisée 1) Mesure de la distance entre les gènes L’estimation de la distance repose sur la fréquence de recombinaison (échange entre la zone homologue qui se traduira par des modifications du génotype) La fréquence de crossing-over est proportionnelle à la distance. Plus la distance entre 2 marqueurs génétiques est grande et plus il y aura de crossing-over. La fréquence de co-transduction est la fréquence à laquelle 2 marqueurs génétiques est transférée. La fréquence de co-transduction diminue quand la distance augmente  D = L (1-𝑓 ) d = distance en minute génétique L = taille de la particule transductrice ; L = 2min f = fréquence de 2) Autre application : cartographie par transduction Les mérozygotes formés par transduction permettent d’établir la liaison entre les gènes bactériens. La transduction d’une souche donneuse a+b+ vers une réceptrice a-b- produit différents types de transduits a+ et b+. Le rapport transduits pour un seul des gènes sur le nombre total de transduits est égal à : (a+b-)/((a+b-)+(a+b+)) Ou (a-b+)/((a-b+)+(a+b+)) Exemple : Sort des marqueurs non sélectionnés dans une série de transduction par P1. (donneuse leu+thr+azir ;réceptrice leu-thr-azir) Expériences 1 2 3

Marqueur(s) sélectionné(s) Leu+ Thr + Leu+ et Thr

Marqueur(s) non sélectionné(s) 50% azir ; 2% thr 3% leu ; 0% azir 0% azir

Expérience 1 : Thr leu azi Ou Thr azi leu Expérience 2 : elle montre que leu est plus proche de thr que de azi de sorte que la carte doit être Thr leu azi

Expérience 3 : nous voyons que les fragments transduits correspondants ne portent jamais le locus azi donc azi est très loin de ce groupe de gènes.

Application de la transduction spécialisée On s’intéresse ici au bactériophage lambda. Les bactériophages lambda ont une taille de 48 502pb. Ils peuvent réaliser soit un cycle lytique soit la lysogénie. Les phages pouvant faire ces 2 processus sont appelés tempérés. L’ADN d’un lambda s’intègre dans le chromosome bactérien dans un site spécifique situé entre gal et bio. Le maintien de l’état lysogène est un phénomène actif. Une bactérie lysogène pour lambda devient insensible à l’infection par un autre lambda. On qualifie ce phénomène d’immunité. L’intégration du phage dans le chromosome bactérien nécessite la présence de 2 gènes qui sont Int (qui code l’intégrase) et une protéine de la bactérie appelée IHF (facteur d’intégration de l’hôte). La protéine IHF est une protéine de 20kDa et cette protéine est composée de 2 sous-unités qui sont les produits des gènes HIM A et HIM D. La protéine IHF n’est pas une protéine indispensable pour la recombinaison homologue chez E.Coli. La recombinaison site spécifique peut avoir lieu in vitro, mais il faut des quantités importantes d’intégrases et de l’IHF. Cette réaction implique une coupure et une réunion précise en l’absence de toute synthèse d’ADN. La séquence AttP a une longueur de 240pb alors que la séquence AttB a une taille de 23pb. Cette différence de taille suggère que ces séquences ont des rôles différents au cours de la recombinaison. La séquence O de BOB est identique à celle de POP. La séquence attP doit être sous forme super-enroulée et sur cette séquence se fixe la protéine IHF et l’intégrase pour former une structure appelée Intasome. On a accrochement des 2 séquences ce qui permet l’intégration de l’ADN phagique dans le chromosome bactérien. Intégration de lambda dans le chromosome bactérien en un site spécifique situé entre gal et bio :  Att B : BOB’  Att P : POP’ Pour qu’il y ait intégration de l’ADN phagique dans le chromosome bactérien, il faut la présence du produit du gène int (bactériophage) => Intégrase Ainsi qu’une protéine de la bactérie hôte IHF (Integration Host Factor, facteur d’intégration de la bactérie hôte) L’excision L’excision nécessite Int, Xis et IHF. Xis joue un rôle important.

La protéine IHF est une protéine de 20kDa, elle est composées de 2 sous-unités qui sont les produits des gènes him A et him D. Elle n’est pas indispensable à la cellule hôte et n’intervient pas dans la recombinaison homologue chez E.coli La recombinaison site-spécifique implique une coupure et une réunion précise en absencec de toute synthèse d’ADN :  La séquence Att P : 240pb  La séquence Att B : 23pb Ces 2 séquences ont des tailles différentes et ne jouent pas le même rôle. Les protéines Int et IHF se fixent coopérativement sur AttP et doivent impérativement être de forme surenroulée. Le superenroulement de AttP est nécessaire à la formation de l’intasome. Puis, les 2 sites sont réunis ce qui permet l’intégration de l’ADN phagique dans le chromosome bactérien.

La lysogénie La lysogénie est maintenue par un circuit autonome. A partir du promoteur de gauche (PL) : transcription de N par l’ARN polymérase bactérienne. A partir du promoteur de droite (PR) : transcription de CRO par l’ARN polymérase de la cellule hôte (bactérie). Dès l’infection : transcription des gènes précoces immédiats du phage. La traduction de ces messagers donne respectivement la protéine N et la protéine CRO. N = facteur d’anti-terminaison dont l’action au niveau des sites nut permet la transcription des gènes précoces retardés. « CRO : deux fonctions : empêche la synthèse du répresseur et interrompt l’expression des gènes précoces immédiats ». Grâce à N : transcription des gènes précoces retardés : cII et CIII. En présence de CII et de CIII : transcription de CI à partir du promoteur PRE (promoteur de mise en place de la répression). CII et CIII sont indispensables pour la transcription de CI à partir du promoteur PRE. CII : protéine instable in vivo, dégradée par une protéine de la bactérie hôte HflA. Le rôle de CIII est de protéger CII de cette dégradation.

La transcription à partir de PRE conduit à la lysogénie de 2 façons : - Effet direct = traduction de CI - Effet indirect transcription de Cro, mais la partie 5’ de ARNm cro est complémentaire de ARNm CI donc appariement  Arrêt de la synthèse de cro. La protéine CI est un répresseur. Elle se fixe immédiatement sur OL et OR et inhibe toute transcription à partir de PL et PR. La fixation du répresseur interrompt l’expression de tous les gènes du phage  ARRET de la synthèse de CII et CIII. CII et CIII sont rapidement dégradées  PRE ne peut plus être utilisé  Pour la transcription de CI MAIS le répresseur est sur OR => Il enclenche la mise en place de l’expression de CI à partir de PRM (maintient de la lysogénie)  Maintien de la lysogénie LYSOGENIE = ADN du phage intégré dans le chromosome de la bactérie hôte.

Cycle lytique du bactériophage lambda CRO = dimère (sous-unité de 9kDa), la protéine CRO a 2 effets : o Elle empêche la synthèse de CI par l’intermédiaire du système de maintien de la lysogénie  pas de transcription à partir de PRM o Elle interrompt l’expression des gènes précoces immédiats  donc empêche la synthèse du répresseur CI. CRO se fixe sur les mêmes opérateurs que CI : la structure de CRO est proche de CI. CRO se fixe sur OR3 donc pas de fixation de l’ARN polymérase sur PRM : pas de mise en route du système de maintien de la lysogénie ! Puis CRO se fixe sur OR1 ou OR2 : Arrêt de la production des protéines précoces dont celle de CRO. CII est instable, toute utilisation de PRE est stoppée Les 2 actions de CRO bloquent la synthèse du répresseur La synthèse de Q  expression des gènes tardifs du phage : production de particules phagiques ce qui engendre la lyse des bactéries. Un équilibre délicat entre lysogénie et lyse  CII joue un rôle essentiel entre lysogénie et lyse  CII actif synthèse du répresseur à partir de PRE  CII inactif, la synthèse du répresseur ne peut être initiée et CRO se fixe aux opérateurs  CII décide dans tous les cas de l’évolution de l’infection Milieu riche = lyse ; Milieu pauvre = lysogénie...