Microbiologie - Cours magistral de Licence en biologie et diagnostic médical. PDF

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Cours magistral de Licence en biologie et diagnostic médical....

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Microbiologie

I)

Présentation (Culture et croissance)

La microbiologie est la sciences qui va étudier tous les être vivants qui sont trop petits pour être étudier à l’œil nu. Tout ce qu’on appelle les champignons filamenteux sont intégré dans la micobio. Seulement une fois assez grand on peut les voir à l’œil nu (mycologie) Cela va inclure des êtres vivants des 3 domaines (Bactéries, Archébactéries, eucaryotes unicellulaires) Historique : ! Antoine van Leeuwenhock (1632-1723) / Robert Hooke (1635-1703) Antoine était hollandais, marchand de grain. A son époque on connaissait le microscope. Il s’est intéressé et à construit ses propres microscopes. Ses dessins peuvent être reconnu actuellement car ils sont très précis. En même temps Robert Hooke a fait la même chose. Ils ont échangé une correspondance et s’envoyaient leurs résultats. On parlait d’Animalcule (animaux très petits). ! Spallenzani (1729-1799) : Laisse pourrir des choses et il constate que quand le flacon est fermé il ne se passe rien. Il n’y a donc pas de génération spontanée. On a donc dit qu’il fallait de l’air pour les générations spontanées (pb non résolu donc) ! Louis Pasteur (1822-1895) : Il a résolu le problème des générations spontanées en utilisant des flacons en col de cire (se prolonge d’une ouverture). Ainsi si on met quelque chose susceptible de moisir dans ce flacon, il ne se passe rien. Pourtant cela communique avec l’air. Au bout de quelques jours il penche le flacon pour que le liquide passe dans le flacon = liquide moisie le lendemain è Il y a donc des germes dans l’air qui se dépose à l’entrée du tuyau. Il montre aussi que la présence de levure est liée à la présence d’alcool Il s’agit du premier à prêcher l’hygiène du domaine médical (se laver les mains avant d’opérer/d’examiner) Il fonde l’Institut Pasteur ! Robert Koch (Allemand) (1822-1895) : Il déteste Pasteur. Il a découvert le bacille de la tuberculose et le bacille responsable de la maladie du charbon . Il invente le milieu solide. Prix nobel de médecine. ! Beijerinck (hollandais) (1898) : Découvre le premier virus ! Winogradsky (1890) : S’intéresse aux microorganismes de l’environnement. Il commence à étudier le cycle de l’azote et que certains microorganismes contribuaient à ce cycle.

! Jacques Monod (1910-1980): Commence sa carrière en étudiant des courbes de croissance. Il étudie le lactose sur E. coli et découvre l’opéron lactose et les ARNm. Il s’intéresse aussi au fonctionnement des enzymes allostériques

Immunologie -> MICROBIOLOGIE microbiologie 1) Présentation des microorganismes Carl Woese (microbiologiste américain) (1980) : 1980 : première méthode de séquençage de l’ADN Et Woese regarde les régions communes aux êtres vivants (ARNribosomique) Plus précisément l’ARNr 16S-18S et a comparé les séquences et construit un arbre. Tous les eucaryotes étaient ensemble mais 2 groupes chez les procaryotes. Il a donc réalisé qu’il y avait une catégorie particulière de bactérie (archébactéries) qui donnait l’impression d’avoir gardé des caractères très ancien. è Proposition de revoir la classification et de créer un niveau hierarchique supplémentaire appelé domaine. Il existe donc 3 domaines (eucaryotes, bactéries, archébactéries) (tableau comparant les trois domaines poly de cours) Raven : p518-523 Les archébactéries se différencient notamment avec : - Les lipides membranaires (avec la température mb devient monocouche, la conformation du glycérol -> symétrie inversée, les membranes des bactéries et des eucaryotes comportent des stérols alors que les mb des archébactéries sont dépourvues de stérols) - Méthanogénie (présente chez les archébactéries et que chez les archébactéries) - Absence de photosynthèse chez les archébactéries - ATP Synthétase A0A1 - Paroi sans peptidoglycane 2) Culture et croissance

Le milieu de culture doit contenir : - Des nutriments (aliments essentiels) : Substrat qui vont permettre à la cellule de fabriquer sa propre biomasse

Element (% poids sec)

Minéraux

Organique

Carbone (50) Oxygène (20) Azote (15) Hydrogène (10) Phosphore (3)

CO2 H2O NH4 , N2, NO3-, NO2H2O, H+ … Phosphate

Sucres, lipides, AAS … AAS, bases, -NH2 Tous les phosphorylés

composés

Soufre (1) Sels minéraux ( permet de faire un isolement Liquide

Milieu synthétique ou chimiquement défini Milieu complexe ou empirique : soupe, extrait de viandes -> riche donc beaucoup de bactéries vont pousser mais on ne connait pas la composition exacte du milieu Il faut également faire attention aux facteurs physico-chimique : -

Température : La plupart entre 20-40°, mais aussi a des température plus extrêmes (glaciers > les microorganismes sont en surfusion. On dit qu’ils sont cryophile. / Thermophile / Arché isolé au niveau d’un rift et on a pu la cultiver en labo à 120°).

-

pH : Préfère pH 6-8 mais dans les extrêmes on trouve aussi de la vie (Acidophile / basophile

-

Concentration en sels : Préfère un milieu isotonique 15g/L (concentration moyenne). Mais on trouve aussi dans les concentrations plus élevées (mer, océan -> 35g/L ; lac salé -> halophile)

-

Pression : Barophile -> supportent pressions élevées

Mesure de la croissance : ! Méthode basée sur la numération : -

comptage de colonie grâce à des dilutions sur boîte. (Il faut 10 à 200 colonies sur la boîte).

-

Comptage de cellule via une cellule de Malassez/Thoma.

-

DO : On compare l’intensité de la lumière à l’entrée et à la sortie. Dans le cas d’une substance colorée la lumière est perdue car elle est absorbée par la substance. On a un phénomène de diffusion qui peut aussi entrainer une perte. On fera une courbe étalon Do en fonction de la [cellule]. (Courbe proportionnelle au début puis plat) On fait le zéro du spectrophotomètre avec le milieu de culture et s’arranger pour que les dosages se trouvent dans la partie linéaire de la courbe.

-

Poids sec : Filtre puis centrifuge les cellules. (Poids humide après centrifugation mais pas précis car selon la centrifugation il peut rester de l’eau). On déshydrate la préparation par chauffage doux puis on pèse et on obtient le poids sec. Pour un type de cellule donné la composition de sa biomasse est toujours la même. On fera donc une courbe étalon

Poids secs en fonction de la [cellule] on aura une droite

Courbe de croissance : (cf poly cours) : On distingue différentes phases de croissance : - La phase de latence : nombre de cellule constant. Souvent cela correspond au temps nécessaire pour que les cellules s’adaptent au niveau milieu de culture. On peut supprimer cette phase en ré-ensemencent plusieurs fois. - La phase d’accélération : Les cellules commencent à se diviser mais pas en même temps. (Il existe un système de divisio synchrone mais c’est très compliqué.). La population augmente de plus en vite - La phase exponentielle : On constate que les cellules se divisent à intervalle de temps régulier. La population va doubler à intervalle régulier. C’est ce qui va permettre de caractériser l’exponentielle. Il s’agit d’un temps de génération . (Ex : E Coli toutes les 20mn la population double). Ce temps dépend des conditions de culture, du microorganisme.( ex : bacille tuberculose très lent) G = temps de Génération/ doublement exprimé en minute µ = taux de croissance (inverse de G) exprimé en minute-1 - Phase de ralentissement : La phase exponentielle s’arrête par épuisement du milieu (ex : plus de substrat carboné donc plus de croissance). L’arrêt de la division n’est pas net, cela se fait progressivement. - Phase stationnaire (plus de substrat, conditions défavorables comme le pH) - (Phase de décroissance pas toujours le cas)

Si on cultive E. Coli en présence de glucose + lactose courbe de croissance un peu spéciale. (schéma 1) Présence d’une double croissance. Le premier sucre consommé sera le glucose puis phase de latence opéron l’active s’active et deuxième phase de croissance. Une fois que le lactose est consommé la phase stationnaire démarre A partir du moment ou le microorganisme dispose de plusieurs substrat il peut y avoir diauxie. Il y a un phénomène annexe que l’on appelle la croissance endogène ou cryptique. C’est un phénomène que l’on trouve chez tous les microorganismes. Lorsque l’on a une grande population il y a toujours une petite proportion de cellule plus faibles qui meurent. Ce que l’on constate c’est que la cellule qui meurt (lyse) libère son contenu et les cellules voisines peuvent l’utiliser. En phase exponentielle cela est difficile à mettre en évidence. En phase stationnaire c’est plus simple à visualiser. La croissance endogène est intéressante en milieu naturel. Cela va favoriser l’apparition de mutant et de phénomène d’adaptation. La population pourra repartir à partir des mutants si l’adaptation est favorable. Viable mais non cultivable (VButNC) : Exemple d’une espèce que l’on ne peut cultiver en hiver pourtant celle-ci est présente dans le milieu (océan). Ces bactéries sont vivantes. Cela serait peutêtre un système d’hibernation et donc pas de division.

I)

Métabolisme énergétique - Classification – Transferts génétiques horizontaux

1) Métabolisme énergétique Tableau page 4 : types trophiques ou nutritionnel On remarque la présence de microorganismes dans plusieurs types d’endroit. Certain fonctionne avec des substrat en faible quantité (polyotrophe) Parmi toutes les formes d’énergie connues, il n’y en a ue deux utilisables par les êtres vivants : ! Energie chimique (chimiotrophe) : réaction d’oxydoréduction Il faut que l’organisme se procure un réducteur et un oxydant. Il s’arrange pour faire fonctionner les deux de façon indirecte. L’énergie libérée va être fractionnée ce qui va permettre à l’organisme d’en récupérer une partie au passage. Tous les eucaryotes utilisent des composés carboné organique comme réducteur (ex : Glucose, lipides…). Le glucose sera oxydé par la glycolyse, ce qui va produire de l’ATP et des co-enzymes réduits (= pouvoir réducteur) L’ATP est nécessaire pour faire des synthèses de biomasse Le NADH peut être utilisé de 2 façon : - Si cellule en anaérobie l’excédent de NADH sera oxydé, réaction de fermentation (lactique, alcoolique mais aussi plein d’autres…). Le pyruvate se comportera comme un oxydant interne Les fermentations ne permettent pas de récupérer de l’energie, juste un rôle de recyclage. - La NADH peut alimenter les chaînes respiratoires : au niveau d’une chaîne membranaire il y a un transport d’électron. Ce système est très répandu et permet une récupération efficace de l’energie en créant un grandiant ionique transmembranaire de protons. Dans le cas des eucaryotes eucaryotes il y a un oxydant externe, l’oxygène (schéma 2) Si on passe aux bactéries on peut retrouver la même disposition Ex : E. coli chaine respiratoire p.6 En gris chaine respiratoire que l’on trouve dans une mitochondrie. On remarque d’autres élémets supplémentaires. Il y a deux cytochromes oxydases différentes. Cette bactérie peut utiliser autre chose que l’oxygène comme oxydant final (associé à la chaine respiratoire cette bactérie peut synthétiser une nitrate réductase qui lui permet de recevoir les électrons, et peut utiliser le nitrate comme oxydant qui sera transformé en nitrite). La nitrate réductase peut être observé en condition anaérobie avec un sel de nitrate La bactérie peut aussi utiliser l’eau oxygénée comme accepteur final d’électrons. Les microorganismes utilisant d’autres types d’électrons, utilise la respiration anaérobie. Tableau du milieu de la p.5 contient différents exemples d’accepteurs finaux d’électrons Le réducteur externe peut être minéral et il n’y aura pas les intermédiaires NADH/ATP ils vont donner directement leurs électrons à la chaine respiratoire (tableau bas de la p.5) On distingue de sous catégorie en fonction du type de réducteur : - Externe organique : chimio-autotrophe - Externe minéral : chimio-litotrophe Ex de l’archébactérie Acidianus ambivalens

Aché vivant dans les zones volcaniques, riche en composé soufré. Elle peut vivre dans les conditions anaérobies. Le thiosulfate est le donneur d’électron. Cette arché peut aussi être cultivé en condition anaérobie si on lui fournit du dioxygène et du soufre. Cette arché utilisera alors l’hydrogène comme donneur d’électron et le soufre natif comme accepteur final. A partir d’un moment ou un microorganisme utilise un récepteur minérale externe il n’y aura pas de NADH. Ainsi il faudra en fabriquer un, le système marche à l’envers il y aura du NADH produit à partir de NAD+ Schéma p.7 : Les plus négatifs sont les réducteurs, les plus positifs sont les oxydants. Entre le glucose et l’oxygène il y a une grand potentiel. Delta G très grand donc libère beaucoup d’énergie Entre glucose et nitrate l’écart est plus faible donc E. coli qui respire avec du nitrate a un bilan en ATP plus faible. Arché métanogène ont un rendement plus faible mais cela reste viable. Quand on explore le monde vivant, toutes les réactions d’oxydoréduction thermodynamiquement possibles seront trouvées chez un être vivant. Page 7 : valeur de delta G Tableau en haut de la page 5 : première classification des organismes selon leur besoin en oxygène ou non. Il a 4 catégorie principales Aérobie strict = vraiment besoin d’oxygène. Chaine avec un oxydant final qui est l’oxygène Aéro-anaérobie = Ils ont une chaine respiratoire avec de l’oxygène mais celle-ci peut fonctionner avec d’autres oxydants. Ils peuvent aussi faire appel à des réactions de fermentation Microaérophile = organisme aérobie qui peuvent se contenter de faible concentration en oxygène Anaérobie aérotolérant = n’utilise pas l’oxygène mais s’il y en a ce n’est pas dérangeant Anaérobie strict = pas besoin d’oxygène et oxygène a un effet toxique sur eux.

! La lumière (phototrophe) Les organismes capables d’utiliser la lumière comme source d’énergie (photophie) Il y a en fait deux façons d’utiliser l’énergie lumineuse : - Photosynthèse - Bacteriorhodopsine Certaines bactéries capable de faire la photosynthèse mais aucune archébactérie. Dans la photosynthèse il y a aussi des réactions d’oxydoréductions. Le point de départ est un donneur d’électrons (eau chez les plantes). L’eau libère l’oxygène et grâce à la présence de ce type de photosynthèse il y a de l’oxygène. On connait 5 catégories de bactéries capable de faire la photosynthèse : - Cyanobactéries avec eau comme donneur d’électron - Photosynthèse avec hydrogène, H2S, lactate… Le donneur cède les électrons à un photosystème qui va être activé par la lumière. Une fois activé il va pouvoir céder les électrons reçu à un réducteur fort Ce réducteur fort va transférer les électrons à une chaine membranaire de transport d’électron. Il y avoir production d’ATP et production de NADH. ATP et NADH vont permettre de faire des synthèses Il y aura un cycle de fixation du CO2 On a découvert l’existence de 2 autres cycles fixant le CO2 : - Cycle dans les acides carboxyliques : variante du cycle de Krebs qui tourne à l’envers - Cycle de l’Hydroxyde propionate

Chez eucaryote uniquement cycle de Calvin ! (schéma 3) ! Bacteriorhodopsine : La rhodopsine est une protéine membranaire qu’on trouve dans les neurones de la rétine. Cette protéine est associé au rétinal qui dérive de la vitamine A. Le rétinal peut changer de conformation. A chaque fois qu’il est touché par un photon, il y a un changement de conformation qui induit un changement de conformation de la rhodopsine qui va entrainer un PA.

On a découvert aussi de la rhodopsine chez les archébactéries. Le point de départ est aussi associé au rétinal. Quand il est frappé par un photon il y a bien un changement de conformation mais les conséquences sont différentes. Quand elle change de conformation, un proton passe au travers de la membrane L’énergie nécessaire pour faire sortir le proton sera fourni par la lumière. Système simple qui permet de créer un gradient de proton transmembranaire Les arché et les bactéries possédant ce système sont aussi appelé phototrophe. Pas de système équivalent chez les procaryotes. 2) Classification 3 domaines : arché, eucaryotes, bactéries Dans chaque domaines il peut y avoir des règnes : absence de règne chez arché et bactéries et discuté chez eucaryotes Phylum (5 chez arché , 15 chez bactéries Embranchement Classe Ordre Famille (tribus) Genre Espèce Genre s’écrit toujours avec une majuscule et l’espèce avec une minuscule : Escherichia coli Arbre basé que ARNribosomique (16S-18S). Cette séquence est efficace pour construire des arbres. Elle comporte à la fois des séquences hautement conservées et des portions intermédiaires plus variables, la combinaison des deux permet une classification. D’autres séquences ont été utilisées pour les arbres. Il n’existe pas de systèmes parfait, tous les arbres donne à peu près le même résultat final. Les discussion actuelles portent plus sur l’emplacement des racines/branches qui diffèrent selon les séquences choisies Il y a une IDENTIFICATION : cherche à trouver l’espèce d’une souche isolée (bactériologie médicale) Pour cela il faut décrire tous les caractéristiques de la bactérie. Caractères : - Morphologiques (forme, taille, Gram…)

-

Biochimiques et physiologique (type respiratoire, température optimale, pH , activité enzymatique spéficiques…) Caractères génétiques (pourcentage en G+C%, hybridation totale, PCR, recherche de séquences spécifiques…)

GRAM (p.1) : Les arché n’ont pas de peptidoglycanes dans la paroi Gram + : peptidoglycane important (chaine de polysaccarides reliées par des petites séquences peptidiques Gram - : peptidoglycane moins épais, mais absence d’acide teichoique. Présence d’une membrane externe (composé de lipides, dont le majoritaire est le Lipopolysaccharide (LPS) ). LPS a une extrémité avec un lipide ancrée dans la membrane externe et l’autre moitié polysaccharide. Il peut y avoir une capsule à base de polysaccharides Coloration de Gram fin 19e siècle – système avec une double coloration - Fixation cellule - Violet de Gentiane : toutes les bactéries en violet - Lugol - Décoloration avec l’alcool : certaines se décolorent très facilement, d’autres se décolore difficilement - Recoloration avec la fuschine (rose) La différence de coloration est dû à la paroi (alcool a du mal à pénétrer chez les G+) Mycobactéries difficile à décolorer : paroi sans acide teichoique et membrane externe Systèmes qui permettent la mobilité : - Flagelle - Déformation du cytosquelette (amibes) -> que chez les eucaryotes - Déplacement par glissement : protéine de paroi impliquée dans le mécanisme mais on ne connait pas le mécanisme exact - Spore (aucune arché) : rôle de survie en condition de stress, carence… 3) Transferts génétiques horizontaux Transfère génétique pose des problèmes de classification Un transfert horizontale est l’acquisition d’un fragment d’ADN pas par héritage mais pas un échange entre deux êtres vivants. Les principaux mécanismes sont : - La transformation (découvert chez le pneumocoque : bactérie patho pouvant fabriquer une capsule) : Il a réussi a obtenir des mutants non capsulés qui en présence d’ADN extrait d’une autre souche capsulées devenaient à nouveau capsulés. Ainsi les bactéries ont réussi à introduire de l’ADN extérieur. - Plasmide : Conjugatif (ex : facteur F pouvant s’intégrer dans le génome de la bactérie hôte = Hfr, R) qui porte un gros opéron qui comporte une trentaine de gènes codant pour un ensemble de protéines qui permettent la conjugaison. (tous ne permettent pas la conjugaison) Il y a aussi des plasmides mobilisables. Ils ne peuvent pas provoquer une conjugaison s’ils sont seuls mais s’ils se retrouvent avec d’autres plasmides conjugatifs. Ainsi ils profitent de la conjugaison pour être transféré en même temps.

Il y a tout un tas d’autres plasmides - Virus et bactériophage (bactériophage = virus des bactéries) Il peut y avoir transfert d’ADN chez le bactériophage appelé la transduction. Un phage vient parasiter une bactérie. L’ac nucléique du phage sera injecté à l’intérieur ce q...