TRANSFORMACION DE TYPHA DOMINGUENSIS CON EL VECTOR PRI 101-ON DNA CONTENIENDO EL GEN MERB PDF

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TRANSFORMACION DE LA PLANTA TYPHA DOMINGUENSIS CON EL VECTOR PRI 101-ON DNA CONTENIENDO EL GEN MERB QUE LA HACE RESISTENTE AL MERCURIO...

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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS BIÓLOGO BIOTECNOLOGÍA

PPA llI “TRANSFORMACION DE TYPHA DOMINGUENSIS CON EL VECTOR PRI 101-ON DNA CONTENIENDO EL GEN MERB”

ALUMNOS: Edén Peralta Barrera Espinoza Yáñez Hugo Eduardo Sagrero Temich Marco Antonio Martínez Ayala Flor Elizabeth

Facilitador: Dr. Benito Pereyra Alférez

INTRODUCCION El mantenimiento y la preservación de lo que tenemos como recursos naturales nos ayudan a facilitar el crecimiento o desarrollo de la mayoría de las actividades antropogénicas en las diversas sociedades desarrolladas esto se ha convertido en uno de los retos más importantes para el siglo XXI. La gestión del medio ambiente debe estar debidamente coordinada y relacionada o de la mano con el desarrollo social lo que ahora se conoce como sostenibilidad este concepto tan reciente se emparenta con temas económicos, social y ecológicos en relación entre las sociedades y el medio ambiente todo esto afortunadamente se ha ido trabajando poco a poco y ha ido incrementando progresivamente como una de las demandas sociales en estos tiempos.[ CITATION Ani10 \l 2058 ]. Al igual que el crecimiento en el desarrollo científico entra la Biotecnología ambiental, continúa dependiendo de los avances de las diferentes áreas científicas, así como del conocimiento de los materiales. Es por eso que la forma en cómo actúa la biotecnología ambiental se basa en el correcto aprovechamiento de los recursos naturales, acciones que se llevan a cabo en los sistemas biológicos con el fin de prevenir, mitigar o eliminar la presencia de compuestos contaminantes en el medio ambiente (Blanch, 2007). Las nuevas tecnologías moleculares y su relación con la ecología microbiana y la biotecnología ambiental han permitido un enfoque nuevo del estudio de los consorcios microbianos y extender las aplicaciones no solamente a degradación de compuestos contaminantes si no el ir más allá (Rittmann, 2006). Recientemente los estudios introducen un nuevo concepto denominado gestión de los recursos humanos como herramienta, para poder dirigir diversas áreas de trabajo, el reto actualmente en esta biotecnología es el conocimiento y gestión de los recursos (genes y sus funciones) para con ello poder gestionar los mismos y establecer planes estratégicos medioambientales.

El mercurio, el sexto más tóxico en un universo de 6 millones de sustancias, existe naturalmente en pequeñas cantidades en el medio ambiente, siendo el elemento número 16 más raro en la Tierra. Sin embargo, sus niveles han aumentado debido a la contaminación ambiental causada por actividades humanas, como la quema de carbón y productos derivados del petróleo, el uso de fungicidas mercuriales en la fabricación de papel y la agricultura y los catalizadores de mercurio en la industria, con la consiguiente liberación de mercurio en el aire y el agua. la tierra. Estas actividades pueden aumentar los niveles locales de mercurio varios miles de veces por encima del fondo (Tuovinen, 1984). Uno de los genes más utilizados en esta área es el gen MerB el cual tiene como función resistir al mercurio, de una manera más clara este gen confiere a las bacterias u otros microorganismos la capacidad de resistir las sales de mercurio. Este gen se puede encontrar en Eschelichia coli. Lo cual lo convierte en uno de las bacterias más utilizadas para tratar áreas con altos índices de mercurio. [ CITATION Uni17 \l 2058 ]. ANTECEDENTES 1. MerB MerB es una proteína cistosolica encontrada en bacterias, principalmente en gram-positiva, que proporcionan resistencia a el mercurio y a compuestos organomercuriales. MerB se encuentra dentro del operon Mer en las bacterias, en el cual también se puede encontrar el gen MerA, ambos otorgando resistencia organomercurial. Este sistema de resistencia permite transformar el mercurio toxico de los organomercurios o sales inorgánicas de mercurio en el mercurio elemental, que es químicamente menos toxico, este es eliminado pasivamente por las bacterias por medio de volatilización (Lello, 2010). Esta transformación del mercurio es llevado a cabo al producir una enzima, liasa organomercurial (MerB), que corta el enlace de carbón-

mercurio en organomercuriales produciendo especies inorgánicas menos toxicas (Bizily et al. 1999). El

primer

reporte

de

una

bacteria

degradante

de

compuestos

organomercurios fue Pseudomonas cepa K62, la cual contenía dos formas distintas de la proteína MerB, ambas con la capacidad de degradar compuestos organomercuriales. Aun así, la forma proteica de MerB mas estudiada proviene de la bacteria E. Coli que contiene el plasmido IncM, pR831b (Lello 2010). Bizil et al. (1999) creo una planta transgénica (Arabidopsis thaliana) que expresaba un gen bacterial modificado, merBpe, el cual codificaba liasa organomercurial (merB) bajo el control de un promotor de la planta. Se descubrió que la plantas trangenicas podían crecer en condiciones donde existían altas concentraciones monometilmercurio y acetato fenilmercurio y además poseían resistencia hacia los oragnomercurios, por lo que se concluyo que estas plantas podrían ser usadas para la degradación de metilmercurio en áreas contaminadas. Saouter et al. (1994) realizo un experimento para comprobar la efectividad del operon mer para la reducción de mercurio en aguas contaminadas. Este experimento se realizo en forma de un microcosmos (un aparato de vidrio con diferentes cámaras) que se utiliza para realizar simulaciones ambientales (río, lago, etc.). En una cámara central, el medio contaminado se trata con bacterias reductoras de mercurio. Se encontró que la reducción de mercurio de Hg 2+ a Hg 0 pudo alcanzar una tasa del 95%, lo que demuestra el alto potencial biotecnológico de la reducción de mercurio por mer operón (Saouter et al., 1994). Algunos estudios realizados en laboratorio han descrito cepas bacterianas reductoras de mercurio, con énfasis en Escherichia coli, obtenidas y mejoradas genéticamente mediante la clonación de mer operón y otras técnicas de ADN recombinante (Cursino et al., 2000).

Otros estudios se enfocan en caracterizar genes de liasa organomercurial aislando la bacteria Escherichia coli, las cuales son resistentes al mercurio del tipo salvaje recolectadas en 5 regiones distintas geográficamente en la india. Al amplificar mediante PCR mostro tres genes merB idénticos a E. coli pR831b con un 80-97% de semejanza por lo tanto fue considerada como el mismo gen para las silvestres de las 5 diferentes regiones. Estos estudios sugieren que los cambios genéticos se deben a la presencia continua del mercurio (Murtaza, 2005). En adición a este hallazgo se realizó un trabajo en el cual se explota mIA p3AD3, la cual se trabaja para biorremediacion en sitios contaminados con mercurio. Las células de E. coli DH5 alfa las cuales poseen pIAAD3 merB clonadas en el vector pUC18, se encargan de dividir el acetato fenil mercúrico (PMA) en benceno y mercurio inorgánico de manera eficiente, lo cual demuestra que este producto génico es biológicamente activo (Mutarza, 2005). 2. Typha domingensis Typha domingensis fue descrita por primera vez por Christiaan Henrik Persoon en Synopsis plantarum (1807), de especies encontradas en Santo

Domingo,

(Spencer, 2013).

Republica

dominicana

TAXONOMIA Reino: Plantae Filo: Tracheophyta Subfilo: Angiospermae Clase: Liliopsida Orden: Poales Familia: Typhaceae Genero: Typha Especie: T. dominguensis

Es una hierba acuática, enraizada emergente, puede llegar a tener 2.5 metros de altura. Sus hojas pueden alcanzar la altura de las espigas, asimétricas, aunque en algunas ocasiones pueden ser asimétricas, la epidermis en la parte ventral contiene gran cantidad de glándulas mucilaginosas de color oscuro, el envés es convexo cerca de la vaina y plano hacia el ápice, las láminas tienen un tamaño de hasta 1.5 metros de

largo y 0.8 a 1.3 cm de ancho. Presenta inflorescencias de color moreno claro. El fruto es fusiforme de 1 a 1.5 mm de largo (Vibrans, 2009). Es una planta nativa de México y se encuentra distribuida en Aguascalientes, Baja California Norte, Baja California Sur, Campeche, Chiapas, Coahuila, Colima, Distrito Federal, Durango, Guanajuato, Hidalgo, Jalisco, Estado de México, Michoacán, Morelos, Nayarit, Nuevo León, Oaxaca, Puebla, Querétaro, Quintana Roo, Sinaloa, Tlaxcala, Veracruz, Yucatán (Vibrans, 2009). 2.2 Fitoremediacion La distribución de Typha domingensis ha crecido en los últimos años debido a que puede adaptarse con facilidad a ambientes contaminandos.

Esta

propiedad

combinada

con

su

extenso

crecimiento de biomasa ha permitido el uso de T. dominguensis para en humedales construidos para la remediación de desperdicios urbanos e industriales con metales (Lominchar 2015). En un estudio realizado por Mufarrege (2012) utilizo T. dominguensis para evaluar la capacidad de bioabsorcion de metales demostró que esta especie poseeia una alta tasa de retención de metales y una elevada tolerancia a las condiciones de los efluentes tratados debido a su capacidad de adaptación. Un estudio similar realizado por Lominchar (2015) obtuvo resultados similares al concluir que T. dominguensis posee una alta eficiencia de absorción y acumulación de mercurio en sus órganos. Por lo tanto, su uso como bioindicador y como fitoextractor en áreas contaminadas de mercurio es prometedor.

Gomez M. (2014) demostró que T. domingensis reducia un 99.6 ± 0.4% de mercurio presente en aguas contaminadas, y una alta acumulación de mercurio de 273.3515 ± 0.7234 mg kg−1.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA El metal mercurio presente en cuerpos de agua se considera uno de los contaminantes más tóxicos ya que causa envenenamiento al estar expuesto a las formas solubles en agua (como el cloruro mercúrico o el metilmercurio), por la inhalación de vapor de mercurio o bien por ingestión de cualquiera de sus formas. En la actualidad existen diversas técnicas que ayudan a el tratamiento y biorremediación de estas aguas, las cuales pueden generar efectos secundarios a un plazo largo o muy poco eficientes. Por lo que encontrar nuevas formas de biorremediacion en aguas contaminadas, que sean eficaces, es de suma prioridad en muchos países con este tipo de problemas, en el cual se incluye México. JUSTIFICACION En el último siglo en México, así como en muchos otros países, se han tenido grandes problemas de contaminación debido a la industrialización, por lo que la contaminación en aguas ha ido en aumento, y un problema contundente son los altos niveles de mercurio. Jaramillo (2015) menciona que el mercurio proviene de la minería y de la industria, y que el medio por el que este se transporta es por el agua y por lo tanto puede llegar fácilmente a cualquier organismo que se encuentre en ella. Por lo que con esta investigación se busca encontrar una manera biotecnológica de disminuir la contaminación de mercurio en lagos o ríos. El uso de plantas acuáticas aparece como una opción altamente competitiva frente a otros métodos de tratamiento de aguas contaminadas (Valderrama, 1999). Por lo que se pretende utilizar un transgénico de Typha domingensis, que contenga el gen MerB, el cual convierte organomercurios en mercurio elemental, disminuyendo

la toxicidad. Esta propiedad del gen junto con las propiedades naturales de absorción de mercurio de la planta T. domingensis proporcionarían un gran efecto de biorremediación en lagos o ríos contaminados mejorando la calidad del agua y restaurando el ecosistema a largo plazo. APLICACIÓN En la actualidad existe un problema de contaminación por metales pesados en ecosistemas terrestres, aéreos y acuáticos. Esto debido al uso inmoderado de elementos inorgánicos que afectan considerablemente estos ecosistemas, el enfoque de nuestra investigación y proyecto va dirigido hacia ecosistemas acuáticos

que

han

sido

seriamente

dañados

por

metales

pesados,

específicamente mercurio. Este metal además de ser extremadamente toxico no puede ser degradado como los componentes orgánicos, por lo cual tienden a concentrarse en las redes tróficas y actúan como tóxicos acumulativos (Schoeder, 1973). Se utilizara un transgénico de Typha domingensis, conteniendo el gen MerB, la cual será colocada en áreas donde los ríos/lagos tengan altas cantidades de mercurio presente en zonas calido-humedas, que es donde la planta presenta un mejor crecimiento. De esta forma, nuestro transgénico

T. domingensis, tendrá efecto de

biorremediación en los ecosistemas, como menciona Mufarrege (2012) esta planta posee una alta tasa de retención de metales, presenta una elevada tolerancia a condiciones como pH y salinidad. Además gracias al gen MerB, el cual es una proteína citosólica (Lello, 2010), proporcionara resistencia a altas concentraciones de mercurio y organomercurio, y además permitirá que la planta tenga la propiedad de transformar el mercurio toxico en el mercurio elemental, el cual es menos toxico. De esta forma se eliminara el mercurio del agua tal como Saoter et al. (1994) comprobó al experimentar con este gen. La utilización de T. domingensis al

aplicarle MerB podría brindar una eficacia en la eliminación de mercurio en sistemas acuáticos, los cuales son nuestra principal enfoque de investigación. METODOLOGÍA Obtención del gen merB Para la obtención de ADN de S. aureus se utilizará el kit de QIAGEN Plasmid Mega and Giga y se seguirán las instrucciones de fábrica. El gen de liasa organomercurial (merB) se amplifica por PCR del plásmido pMS97 (acceso genbank ab179623) obtenido de S. aureus. Los primers que se utilizan para

esta

amplificación

son

PI:

CGGATCCCAAATGAAAAATATTTCAGAATTCTCA-3'

y

CGAGCTCGATTGACGCAGGGCTAATTGCCTA-3'. Para

mejor

P2: eficiencia

5'5'de

clonación se añadió un sitio BamHl al primer P1, y un sitio Sacl al primer P2 (Choi et al. 2005). Vector Se utilizará el vector binario de transformación pRI 101-AN DNA (TAKARA; fig. 1), para expresar el gen merB en las células de Thypa dominguensis, esta expresión será después de que Agrobacterium infecte a la planta y transporte el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). El vector esta conformado por las siguientes partes: ColEi ori: Sitio de origen de E. coli Ri ori: Sitio de origen de Rhizobium (Agrobacterium) RB, LB: Las secuencias derecha e izquierda del T-DNA NOS-promotor, NOS-terminador: Promotor o terminador para el gen marcador.

NPTII: Gen marcador en planta AtADH 5’-UTR, OsADH 5’-UTR: región no codificadora de 5' de Arabidopsis o alcohol de arroz gen de la deshidrogenasa (potenciador de la traducción). 35S promotor: promotor del virus CaMV para expresión del gen en la planta. NPTIII: gen marcador seleccionable en E. coli o Rhizobium (Agrobacterium)

figura 1. Vector pRI 101-AN DNA (TAKARA) El promotor a utilizar para la expresión en plantas transgénicas es CaMV 35S, ya que es un promotor muy fuerte (constitutivo o ectópico) que es activo en la mayoría de tejidos de monocotiledóneas (Espinosa-Huerta et. al, 2013). Ligasas La ligación de fragmentos de ADN se llevará a cabo utilizando 1 U de T4 ADN ligasa (Promega), en un volumen de reacción de 10 μl empleando la solución amortiguadora de reacción provista por el proveedor de la enzima. Se utilizarán cantidades de inserto y vector tales que la relación molar entre ambos fuera de 5 a 1. La 42 incubación se realizará durante 16 horas a 4ºC.[ CITATION Man08 \l 2058 ]. Transformación de bacteria

Se introducirá el plásmido recombinante obtenido en una reacción de ligación en la bacteria Escherichia coli por medio de electroporación. La preparación de las células competentes y las condiciones de electroporación empleadas serán las recomendadas en el manual del fabricante del equipo (Gene Pulser™ , Bio-Rad). El choque eléctrico se realizará en cubetas de 0,25 cm (Bio-Rad). Inmediatamente después del disparo se adicionará 1 ml de medio LB a la suspensión de células y la mezcla se incubará durante dos horas a 28 ºC. Después de centrifugar a 4000 g durante cinco minutos, el sedimento celular se resuspenderá en 100 μl de medio LB y se sembrara en placas de Petri que contenían medio LB suplementado con los antibióticos adecuados. Las placas serán incubadas a 28 ºC hasta la aparición de colonias (aproximadamente 48 horas)[CITATION Man08 \l 2058 ]. En una placa A se siembra la bacteria utilizada sin transformar y en otra placa B la bacteria que se transformó con la mezcla de ligación y en otra placa C con una cantidad de DNA de vector conocida (unos 1-5 ng). En la placa A no se observarán colonias ya que la estirpe hospedadora utilizada es sensible a ampicilina. En la placa B aparecerán dos tipos de colonias blancas y azules, seleccionadas por resistencia a ampicilina, ya que ambos tipos de bacterias portan el plásmido. Las colonias azules corresponden a las células transformadas con el vector que lleva el gen de la β-galactosidasa funcional y produce por inducción con IPTG dicha enzima capaz de hidrolizar al X-Gal y generar color azul. Las colonias blancas corresponden a las células transformadas con el vector que lleva un gen de la β-galactosidasa no funcional por inserción de un fragmento de DNA dentro del mismo. Finalmente, la placa C sólo contendrá colonias azules pues portan el vector intacto con una β-galactosidasa funcional. Se contará el número de colonias en B y C, y se determinará la eficiencia de la transformación y de la ligación. Extracción de DNA plasmídico de E. coli por lisis alcalina

Este método aprovecha las diferencias en el tamaño y la super helicidad que es el grado de torsión que sufre el ADN plasmídico en contraste con el cromosomal, Alberto Checa Rojas. (2017). Usando el método de extracción por lisis alcalina se puede obtener entre 100-500 µg de ADN partiendo de 1.5 mL de cultivo de bacterias en fase exponencial con un moderado número de copias (10 a 20 por bacteria).

1.Resuspender el pellet bacteriano en 250 μl de Solución de Resuspensión + 2.50 l de TRUEBLUE Lysis control reagent mediante agitación con vortex o pipeta, asegurándose de la completa resuspensión de las células. NOTA: Preparar suficiente Solución de Resuspensión EP01/ TRUEBLUE Lysis control reagent para el número de minipreps que se han de realizar. Se formará un precipitado después de la adición del TRUEBLUE lysis control reagent que no afectará. Agite para su disolución. 2.Lisar las células con 250 μl de Solución de Lisis. Suavemente invertir el tubo 8-10 veces hasta que la mezcla aparezca clara y viscosa. No utilizar vortex. Se puede incubar 3 minutos, pero nunca más de 5 minutos. 3.Neutralizar añadiendo 350μl de Solución de Neutralización / Unión. Suavemente invertir el tubo 8-10 veces. Se recomienda la incubación durante 5 minutos en hielo. 4.Centrifugar a máxima velocidad en una microcentrifuga durante 5 minutos. Si hubiera partículas flotando en el sobrenadante, volver a centrifugar. 5.Cuidadosamente pasar el sobrenadante a una Spin microcolumna con su tubo de recogida. 6.Centrifugar a máxima velocidad durante 30-60 segundos. Sacar la Spin micro columna del tubo de recogida y colocar en un nuevo tubo de recogida. 7.Añadir 600 μl de Solución de Lavado en el reservorio del spin micro columna. Centrifugar a máxima velocidad durante 60 segundos. Eliminar el líquido.

8.Realizar un 2° lavado. Añadir 600 μl de Solución de Lavado en el reservorio del spin micro columna. Centrifugar a máxima velocidad durante 60 segundos. Eliminar el líquido. 9.Centrifugar a máxima velocidad durante 3 minutos para eliminar el etanol residual. 10.Insertar el spin micro columna en un microtubo de 1.5 ml nuevo. Añadir 50100μl de Tampón de elución en el reservorio del spin microcolumna. 11.Incubar 1 minuto. Se recomienda que el tampón esté a 55°C. 12. Centrifugar a máxima veloci...