W4 PDF

Preview

Summary

Download W4 PDF

Description

Budowa i funkcje struktur komórkowych bakterii wykład IV 26 III 2018r

- LPS –

1.     

Synteza: lipid A i rdzeń są syntetyzowane po wewnętrznej stronie CM powstające podj. O-swoiste są przyłączane do baktoprenolu i przenoszone na rosnący łańcuch antygenu O ukończony LPS przenoszony do miejsca adhezji na zewnętrzną powierzchnię OM rfa, rfb, rfe – geny w chromosomie, 3 operony prawidłowa biosynteza LPS jest zależna od kluczowych białek błony komórkowej (poryny etc.)

2. Właściwości fizyko-chemiczne LPS:  właściwości amfifilowe  błona zewnętrzna ma budowę bardzo zwartą, trudno przepuszczalną dla związków hydrofobowych, które łatwiej przenikają przez błonę cytoplazmatyczną  zjawisko tranzycji: zmiana stanu skupienia w zależności od temperatury i długości kwasów tłuszczowych (upłynnienie endotoksyny zależy od składu lipidu A)  dodatek kationów dwuwartościowych wraz z obniżeniem pH otoczenia owocuje usztywnieniem cząsteczki  środowisko alkaliczne = upłynnienie lipidu A 3.    

 

Lipid A: odpowiedzialny za toksyczny efekt kotwiczy cały kompleks w błonie komórkowej aktywuje makrofagi, monocyty do produkcji mediatorów reakcji zapalnej: prostaglandyn, leukotrienów, αTNF i IL-1, IL-6, IL-8, IL-10 wysokie stężenie w środowisku wymienionych cytokin prowadzi do wielokierunkowego, toksycznego oddział. na człowieka lub zwierzęta: podniesienie temp. ciała, obniżenie ciśnienia krwi, aktywacja dopełniacza, rozsiane wewnątrznaczyniowe wykrzepianie krwi efekt: posocznica i wstrząs posocznicowy sepsa z punktu widzenia medycznego nie jest jednostką chorobową, a objawem istniejącej infekcji

4. O-specyficzny łańcuch polisacharydowy:  warunkuje występowanie wariantów antygenowych LPS (serotypowanie bakterii, opis systematyczny szczepów, rodzajów etc.)  rolę składników determinujących swoistość serologiczną antygenów O spełniają reszty cukrowe – terminalne lub występujące jako odgałęzienia boczne  właściwości ochronne przeciwciał – wykorzystanie w szczepionkach; szczepionki antyidiotypowe  aktywacja układu dopełniacza  adhezyna  receptor dla fagów 5.      

Region rdzeniowy – rola biologiczna: receptor dla fagów aktywacja dopełniacza wiąże receptory na limfocytach T swoistość serologiczna LPS mutantów: disacharyd KDO-Hep KDO ważny dla wzrostu i metabolizmu komórki bakterii dotąd nie wyizolowano mutantów nie zawierających KDO, co wskazuje na jego istotną rolę w funkcjonowaniu bakterii

6. Białka surowicy wiążące LPS:  HDL (High density lipoprotein)

   

LBP (Lipopolysaccharide Binding Protein) BPI (Bactericidal/permeability-increasing protein) laktoferyna septyna

Artykuł: Budowa chemiczna i biosynteza LPS – ważnego składnika osłony komórkowej bakterii Gram ujemnych. PHiMD. 2004, 58; 333-342 (http://www.phmd.pl/api/files/view/1760.pdf) 7.     

Komórki organizmu uczestniczące w rozpoznawaniu LPS: monocyty i makrofagi PMC, np. neutrofile limfocyty T i B komórki śródbłonka naczyń krwionośnych i mięśni gładkich

8. Receptory na komórkach układu immunologicznego wiążące LPS: Oddziaływania LPS z komórkami docelowymi dla tej cząsteczki umożliwiają umieszczone na ich powierzchni receptory, które rozpoznają endotoksynę. Należą do nich:  CD14 – na monocytach i makrofagach, rozpoznaje LPS+LBP, postać rozpuszczalna i związana z błoną komórkową  receptor SP ( scravenger) – makrofagi, komórki śródbłonka, komórki Kupffera w wątrobie, wychwytują LPS z krwioobiegu  selektyna L – glikoproteina ekspresjonowana na powierzchni leukocytów, wiążąc się z LPS warunkuje tworzenie się nadtlenku wodoru przez neutrofile  β2-integryny – leukocyty, transmembranowy receptor dla LPS;  receptor Toll-like 2 i 4, czyli TRL2 i TRL4 – receptory te zidentyfikowano u roślin, owadów, ssaków; funkcja kofaktorów przekazujących sygnał do wnętrza komórki w kompleksach receptorowych wiążących LPS, złożonych z CD14 9.      

Mediatory reakcji LPS: anafilatoksyny produkty metabolizmu kwasu arachidonowego Il-1 Il-6 Il-8 TNF

10. Wykrywanie endotoksyn:  biologiczne testy: o Rabbit Pyrogen Test – test pirogenny (gorączkowy) z udziałem królików, zaszczepienie uszu o Limulus Amebocyte Lysate Test – koagulacja krwi (hemolimfy) skrzypłoczy (amebocyty), podobieństwo amebocytów i płytek krwi, koagulacja ma na celu unieruchomienie patogenu; amebocyty są aktywowane śladowymi ilościami LPS; degranulacji ziarnistości w amebocytach, uwolnienie peptydów wiążących się z LPS; czynnik C – działa jak proteaza serynowa (w obecności o



2+¿ ), aktywacja Ca¿

czynnika B, proteoliza koagulogenu, efekt – koagulacja hemolimfy; test komercyjny – LAL Neutrophil Chemiluminescence Test (Assay) – badanie chemiluminescencji krwi (neutrofilów i mediatorów reakcji zapalnej), skriningowy test biochemiczny

niebiologiczne testy: o metody spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego i spektometrii masowej w badaniach nad LPS  wykrywanie składu i jego proporcji LPS  ocena stopnia chemicznej jednorodności preparatu  postać lotna (przemieszcza się w próżni pod wpływem pola, ponieważ sama zawiera ładunek)

o

 analizowana substancja jest jonizowana strumieniem cząsteczek (jonizacja elektronów EI), powstające jony akumulują energię w czasie jonizacji i część z nich rozpada się na jony o mniejszych średnicach metody elektroforetyczne SDS-PAGE  rozdział elektroforetyczny w żelu LPSu  określenie długości LPS

11. VL-LPS (ang. very long LPS):  wysoka funkcja ochronna dla bakterii, choć funkcja nie jest jednak do końca opisana  Salmonella Erlangen - BIAŁKA POWIERZCHNIOWIE (OMP) –

1.    

Wprowadzenie: 1976r – pierwszy opis kanału wypełnionego wodą – poryna od tego czasu dla wszystkich kanałów nieswoistych stosuje się tą nazwę wchodzą w skład błony zewnętrznej i stanowią około 50% masy OM (lipoproteiny, białka integralne, rzadko białka enzymatyczne) poryny występują nie tylko u bakterii G-, ale także u Corynebacterium, Nocardia, Mycobacterium

2. Kanały tworzone przez poryny w błonie zewnętrznej u różnych bakterii mają średnicę od 0,6 do 2,3 nm  w związku z tym różnią się wielkością mogących się przemieszczać przez nie związków  przepuszczalne są dla molekuł, których wielkość mieści się w przedziale od kilkuset Da do około 5 kDa 3.    

Funkcje: adhezja antygeny dla przeciwciał receptory, np. dla bakteriofagów transport

4. Białka Omp bakterii G- mogą pełnić różnorodne funkcje biologiczne:  strukturalne (OmpA)  enzymatyczne: o proteazy (OmpT) o lipazy (Omp 1A) o acetylotransferazy (PagP)  białek wiążących toksyny (OmpX)  adhezyn (NspA, OpcA)  kanałów przystosowanych do eksportu substancji (TolC)  transportujące: o poryny dyfuzji ogólnej (OmpF, OmpC) – transportujące substancje na drodze transportu biernego o poryny specyficzne w stosunku do substratu (LamB, ScrY, FadL, Tsx) – transportujące substancje na drodze transportu biernego o aktywne transportery tworzące systemy transportowe wymagające energii (FhuA, BtuB)  część białek OMP jest zaangażowanych w pompy efflux → zjawisko oporności na antybiotyki PYTANIE: Jaki jest udział białek OmpC i OmpF w utrzymaniu prawidłowej gospodarki jonowej w komórce? Poryny OmpF i OmpC są porynami dyfuzji ogólnej, a więc transportują substancje na drodze transportu biernego, zależnego od stężenia tej substancji po obu stronach membrany. Ich rola w utrzymaniu prawidłowej gospodarki jonowej w komórce polega na ułatwianiu przepływu jonów w poprzek błony zgodnie z ich stężeniem w środowisku jak i na terenie komórki bakteryjnej. 5. Budowa:



Integralne białka Omp zbudowane są z amfipatycznych, równolegle do siebie ułożonych beta-wstęg, które fałdują się w cylindryczne struktury występujące jako:    

monomery (OmpA, FhuA) dimery (Omp1A) trimery (OmpF, LamB) wnętrza tych struktur tworzą kanał lub kanały, kontakt między monomerami jest stabilizowany dzięki wiązaniom hydrofobowym i polarnym.

6. Pospolitym modelem budowy Omp jest beta-baryłka:  baryłka przebija całą błonę  glicyna, reszty tryptofanu, tyrozyna Artykuł: Białka osłony komórkowe pałeczek jelitowych i ich udział w patogenności oraz odporności przeciwbakteryjnej. Post. Hig Med. Dosc. 2009. 63: 176-199 (http://www.phmd.pl/api/files/view/25864.pdf) 7. Insercja Omp do błony OM:  prekursory białek: cytoplazma, usuwanie sekwencji sygnałowej  dojrzałe polipeptydy: błona cytoplazmatyczna – translokaza SEC: cytoplazmatyczne białko secA o właściwościach ATPazy + kompleks 6 białek tranblonowych; → przestrzeń periplazmatyczna  fałdowanie Omp, tworzenie monomerów, dimerów, trimerów: fałdowanie: białka FOLDAZY: SurA, FkpA, PpiD, DsbA  bakterie, które mają defektywną syntezę LPS, mają także zaburzenia w fałdowaniu i umiejscawianiu białek Omp → prawidłowy LPS = prawidłowy proteom u bakterii (Wyjątek: N.meningitidis: mutanty pozbawione możliwości syntezy kompletnego LPS prawidłowo umiejscawiają Omp w OM)  Omp85 – ewolucyjnie konserwatywne, geny obecne we wszystkich zsekwencjonowanych genomach bakterii Gram ujemnych; homologiem tego białka jest białko występujące w mitochondriach – Tob55 lub Sam50, w chloroplastach – Toc75 → prawdziwość założeń teorii endosymbiozy? 8. OM i enzymy:  OM jest ubogo enzymatyczna  generalnie w OM bakterii G- zlokalizowanych jest znacznie mniej białek enzymatycznych w porównaniu do CM  w OM można stwierdzić aktywność enzymatyczną: o fosfolipaz, o lizofosfataz, o proteaz, o peptydaz sygnałowych 9. Środowisko ma ogromny wpływ na przebieg syntez i obecność danych struktur w komórce – presja środowiskowa! 10.   

Środowisko a ekspresja Omp: obecność maltozy lub maltodekstyn w środowisku – ekspresja białka LamB E.coli niedobór fosforanów podwyższa ekspresję białka OprP u P.aeruginosa drobne zmiany strukturalne w obrębie LPS mogą zaburzać ekspresję białek błony zewnętrznej m.in. OmpF czy OmpA wskazując w ten sposób na kluczową rolę LPS w procesie insercji poryn do OM

ZADANIE: Regulacja syntezy poryn OmpC i OmpF odbywa się na zasadzie dwuskładnikowego systemu regulacyjnego, jaki to ma związek z ochroną komórki bakterii przed kwasami żółciowymi w organizmie wyższym?

11. Omp jako czynniki wirulencji:

Białka błony zewnętrznej

Gatunek N.meningitidis N.gonnorhoeae Inne gatunki z rodzaju Neisseria 12.      

Związane z adhezją 5 klas białek Proteina II lub białko Opa nieznane

Funkcjonujące jako poryny PorA, PorB Proteina IA i Proteina IB nieznane

Blokujące wiązanie przeciwciał 4 klasy białek Proteina III nieobecne

Adhezja z udziałem Omp: Tia, Tib u E.coli (jelita) BabA2 H.pylori (błona śluzowa jelita) OmpD S.Typhimurium (jelita) Opa, Opc H.influenzae (nabłonek górnych drób oddechowych) MOMP (Major Outer Membrane Protein) Chlamydia oporność na sole żółciowe i detergenty: OmpT, OpU Vibrio cholerae

Artykuł: Rola niefimbrialnych adhezyn: białka błony zewnętrznej i lipopolisacharydu w adhezji i inwazji bakterii do komórek gospodarza. 2010. Kosmos. (http://kosmos.icm.edu.pl/PDF/2010/161.pdf) 13. Udział Omp w odpowiedzi immunologicznej:  OmpC S.Typhimurium pośredniczy w przyleganiu bakterii do makrofagów  funkcją immunologiczną poryn S.Typhimurium jest także zdolność do indukowania uwalniania podczas infekcji z ludzkich monocytów: czynnika nekrotycznego nowotworu (TNF-α), IL-1α, IL-6, IFN- ɣ, IL-4 z ludzkich limfocytów 14. Powtórz: ścieżki aktywacji dopełniacza:  4 droga? niektóre cukry bakteryjne mogą aktywować  składowa C3

15.    

Funkcje Omp a aktywacja dopełniacza: Omp wiążą białko C3b oraz C4b – degradacja, rozbicie konwertaz Omp przyłączają czynnik B- blokowanie powstawania konwertazy C3bBb Omp S.enterica – hamowanie polimeryzacji MAC powierzchnia komórki Aeromonas hydrophila bardziej efektywnie wiąże C1q, kiedy w błonie zewnętrznej występuje poryna o masie 39 kDa – aktywacja komplementu drogą klasyczną

16. OmpA → LPS? Makrofagi ludzkie i mysie mogą ulegać aktywacji w wyniku ich połączenia z OmpA K.pneumoniae. Obserwacja ta daje podstawę do wysunięcia hipotezy, iż w związku z tym, że OmpA występuje często w błonie zewnętrznej Enterobacteriaceae i jest białkiem konserwatywnym, układ immunologiczny kręgowców nabył zdolność do rozpoznawania tego białka na powierzchni drobnoustrojów, co umożliwia aktywację układu immunologicznego poprzez tę klasę bakteryjnych protein. Mutanty bakteryjne w stosunku do białka OmpA nie się zdolne do prawidłowej syntezy LPS i odwrotnie....