Warunki hodowli roślin. PDF

Preview

Summary

Metody kultur in vitro 3. Warunki hodowli 1. Warunki wzrostu w kulturach in vitro. Eksplantaty hodowane na w kulturach laboratoryjnych na wiele ich wzrost i oraz przystosowanie do ex vitro. W naczyniach hodowlanych w fitotronach notowane jest niskie zwykle mniej 50 ( PAR przy wykorzystywanym fotoper...

Description

Metody kultur in vitro Wykład 3. Warunki hodowli roślin. 1. Warunki wzrostu roślin w kulturach in vitro. Eksplantaty hodowane na pożywkach w zamkniętych kulturach laboratoryjnych narażone są na wiele czynników znacząco wpływających ich prawidłowy wzrost i rozwój oraz późniejsze przystosowanie do warunków ex vitro. W naczyniach hodowlanych przebywających w !"#$% fitotronach notowane jest niskie natężenie światła, zwykle mniej niż 50 & PAR przy # !×!( najczęściej wykorzystywanym fotoperiodzie 16 godzin światła i 8 godzin nocy (16L/8D). Panuje w nich wysoka wilgotność względna powietrza (95-100%) i względnie stała temperatura powietrza na poziomie od 20 do 28°C. Przez te czynniki wymiana gazowa jest bardzo słaba, co wywołuje niedobór CO2, występuje także niska dostępność O2, zwłaszcza korzeni rosnących w podłożach stałych. Taka niska zawartość dwutlenku węgla skutkuje niską wydajnością fotosyntezy i wymogiem suplementacji roślin poprzez skład pożywki, która zawiera: cukry na poziomie od 1 do 3% (najczęściej sacharozę), a także wysoką zawartość składników mineralnych (2-3 razy wyższą niż w glebie). Wewnątrz naczyń po pewnym czasie akumuluje się duża ilość etylenu (C2H4) oraz szkodliwych metabolitów np. fenoli (w podłożu hodowlanym). Roślinne kultury in vitro rzadko są w pełni autotroficzne. Oprócz podłoża, światła, temperatury, wilgotności i składu powietrza na fizjologię roślin w kulturach wpływa także rodzaj naczyń hodowlanych, w których się znajdują. 2. Czynniki wpływające na fizjologię roślin w kulturach in vitro. Naczynia hodowlane – w których utrzymywane są eksplantaty to pojemniki mające zapewniać stabilność warunków hodowli oraz całkowitą izolację od środowiska wewnętrznego. Nie istnieją uniwersalne naczynia do prowadzenia kultur in vitro, a ich dobór jest eksperymentalny i zależy od rodzaju hodowli, gatunku czy tempa wzrostu. Rozmiar naczyń determinuje wielkość rośliny: • duże naczynia zapewniają mniejszy nakład pracy; • małe naczynia powodują wolniejszy wzrost, jednak oszczędność miejsca (wykorzystywane w bankach tkanek). Wielkość pojemników wpływa także na stosunek: wielkość rośliny/objętość pożywki, wielkość rośliny/objętość powietrza, objętość powietrza/objętość pożywki. Oprócz rozmiaru, również kształt, materiał i rodzaj zamknięcia naczynia wpływają na: • wymianę gazową; • skład powietrza wewnątrz; • skład spektralny światła; • natężenia światła. POJEMNIKI SZKLANE

POJEMNIKI PLASTIKOWE

wielokrotnego użycia

zazwyczaj jednorazowe

możliwość dokładnej sterylizacji

nie wszystkie można sterylizować

wysoki nakład pracy koszt początkowy jest wysoki, w trakcie eksploatacji maleje lepsza transmitancja światła

często sterylne jedynie w opakowaniu zbiorczym niski nakład pracy jednak z produkcją dużej ilości odpadów koszt początkowy jest niski, rośnie w trakcie eksploatacji

Tabela 1. Charakterystyka pojemników do hodowli wykonanych z rożnych materiałów.

Często naczynia hodowlane wykonane są z kombinacji różnych materiałów np.: szklane naczynie + plastikowa nakrywka. Podłoże – materiał znajdujący się najczęściej na dnie naczynia hodowlanego zawierający substancje suplementujące pobierane przez korzenie lub całe komórki eksplantatów. Najczęściej stosowanym podłożem jest pożywka zawierająca substancje żelujące takie jak agar, agaroza czy guma gellan 1. Struktura oraz stężenie takiego żelu wpływają na dostępność wody, składników mineralnych, hormonów oraz na dyfuzję substancji wydzielanych przez rośliny i dostępność tlenu. Potencjał wodny żelu (Ψw) zależy od jego stężenia i składa się na niego: • potencjał osmotyczny (Ψs); • potencjał ciśnieniowy (Ψp); • potencjał matrycowy (Ψm), który decyduje o dostępności wody w podłożu. Każda pożywka charakteryzuje się różnymi właściwościami: twardością 2, sprężystością, kohezyjnością czy gumowatością, które także wpływają na warunki hodowli i można zmierzyć je przy użyciu teksturometru. Rośliny w różnych fazach rozwoju preferują inną twardość: pożywki płynne będą korzystniejsze dla wcześniejszych faz rozwoju osobniczego (przyspiesza proliferację czy tworzenie zarodków somatycznych) natomiast pożywka twardsza dla późniejszych etapów (morfogenezy czy różnicowania). Alternatywnymi rodzajami podłoży w stosunku do pożywek żelowych są: • pożywki całkowicie płynne; • podłoża dwufazowe (faza stała + faza płynna), które charakteryzują się różnym składem (np. hormonów), a także możliwością dodania substancji bez konieczności pasażu, co w konsekwencji daje połączenie korzystnych efektów obu rodzajów pożywki np. u Pyrus communis: o duża liczba pędów przybyszowych w pożywce płynnej z jednoczesnym zapobieganiem witryfikacji przez pożywkę stałą; • membrany z tworzyw sztucznych umożliwiających łatwą wymianę pożywki: o polipropylen (PP); o poliuretan (PU); • dzianiny typu „polar”; • bibuły filtracyjne; • koreczki celulozowe (ang. sorbarods); • wermikulit; • wermikulit w połączeniu z puplpą papierową; • immobilizowane komórki. Pożywki płynne mają korzystny wpływ na namnażanie się niektórych gatunków w określonych fazach rozwoju, a także zapewniają szybszy wzrost poprzez zapewnienie większej powierzchni pobierania i szybszej dyfuzji składników odżywczych oraz toksycznych metabolitów. Prowadzenie kultur na podłożach płynnych skutkuje mniejszym nakładem pracy, jednak ze względu na niską rozpuszczalność tlenu w wodzie konieczne jest mieszanie lub napowietrzanie pożywki lub utrzymywanie eksplantatów nad jej powierzchnią. Jest to trudne w przypadku małych eksplantatów (np. zarodków somatycznych), które mogą tonąć w pożywce, a wytrząsanie czy mieszanie może powodować ich uszkodzenia. Dlatego też do pożywek dodaje się preparaty zwiększające ich gęstość np. Ficoll. Hodowla większych roślin na podłożach ciekłych może również doprowadzać do hiperuwodnienia korzeni. Niemniej jednak pożywki te są popularne a ich modyfikacje mogą niwelować wady i uwidaczniać zalety. 1

z pożywkami zawierającymi w swoim składzie substancje żelujące związane jest zjawisko synerezy, czyli wydzielania wody z żelu, co powoduje zwiększanie jego stężenia i tym samym twardości podłoża. 2 twardość podłoża zależy przede wszystkim od wartości pH (wzrost pH = wzrost twardości pożywki).

Rysunek 1. Kultury wilca ziemniaczanego hodowanych na różnych typach podłoży.

Temperatura – miara średniej energii kinetycznej ruchu i drgań wszystkich cząstek tworzących dany układ. W warunkach naturalnych jej wartości wahają się, natomiast w fitotronach są one względnie stałe i dla większości gatunków lub typów kultur wynosi od 20 do 28°C (nieco wyższe niż normalnie w warunkach in vivo w celu przyspieszenia wzrostu eksplantatów, przy czym w naczyniu hodowlanym temperatura jest zawsze wyższa przez wpływ światła). Czasem stosowana jest różnica temperatur w trakcie trwania fotoperiodu, czyli między okresami dnia i nocy np. w stosunku 25/20°C, co powoduje: • specyficzny wpływ na wzrost i morfogenezę; • ograniczenie intensywności oddychania w ciemności; • wspomaganie wymiany gazowej; • oszczędność energii. Jeśli w jednym fitotronie znajdują się gatunki lub kultury różnego typu, to niezbędne jest uśrednienie warunków temperaturowych co nie jest proste, ponieważ każda z roślin charakteryzuje się specyficznym zakresem optimum cieplnego: • T < optymalnej powoduje stopniowe spowolnienie wzrostu; • T > optymalnej powoduje natychmiastowe zahamowanie wzrostu i zmiany w wyglądzie (chlorozy lub deformacje). Manipulacja temperaturą może być jednak korzystna w niektórych przypadkach: • wysoka temperatura wykorzystywana jest w termoterapii, czyli eliminacji wirusów (>30°C przez kilka tygodni) lub hodowli roślin tropikalnych (24-32°C); • niska temperatura natomiast: o poprzez spowolnienie wzrostu umożliwia tworzenie banków tkanek; o indukuje tworzenie mikrobulw (tuberyzacja np. u ziemniaków) lub mikrocebul (np. u lilii lub tulipanów); o jest niezbędna do zajścia wernalizacji (indukcji kwitnienia roślin ozimych i wieloletnich), stratyfikacji (indukcji kiełkowania) czy przełamania spoczynku roślin cebulowych i drzewiastych (1-10°C); o umożliwia selekcjonowanie roślin pod względem odporności na niskie temperatury. Warunki cieplne wpływają także na morfogenezę w warunkach in vitro:

•

•

indukcja wytwarzania pąków przybyszowych: o niska temperatura np. u Begonia; o wysoka temperatura np. u Vitis vinifera; o krótki okres niskiej temperatury np. u pomidora. indukcja wytwarzania korzeni przybyszowych następuje często w wąskim zakresie temperatur: lekko obniżona temperatura działa na drzewa szpilkowe, a lekko podwyższona na drzewa owocowe jak np. jabłoń.

Rysunek 2. Mikrobulwy ziemniaka, których wytwarzanie w procesie tuberyzacji in vitro zapewnia wolność od patogenów i niewielkie rozmiary ułatwiające magazynowanie, transport czy składowanie w bankach genów.

Wymiana gazowa – proces, w czasie którego dochodzi do dyfuzji gazów i ich wymiany pomiędzy organizmem lub jego częściami a otoczeniem zewnętrznym. Zachodzi w wyniku masowego przepływu powietrza, dyfuzji lub konwekcji, a w warunkach in vitro jest bardzo ograniczona i zależy m.in. od: • różnicy ciśnień; • różnicy temperatur; • stężenia gazów wewnątrz i na zewnątrz naczynia; • zewnętrznego ruchu powietrza. Aby umożliwić eksplantatom wymianę gazową często należy znaleźć kompromis pomiędzy maksymalnym zabezpieczeniem sterylności hodowli a dostępem powietrza z zewnątrz. Najczęściej stosuje się niedopasowane zamknięcia lub półprzepuszczalne błony jako pokrywki do naczyń, w których hodowana jest roślina, czasem jednak stosowana jest dodatkowa wentylacja kultur, mieszanie lub suplementacja CO2. Całkowite odizolowanie kultury od środowiska zewnętrznego powoduje również nadmierną akumulację etylenu. Problem wymiany gazowej w hodowlach in vitro jest ściśle związany z dostępnością tlenu dla roślin, która zależna jest od: • stężenia O2 w atmosferze zewnętrznej; • szybkości jego dyfuzji do naczyń hodowlanych, która zależy od kształtu naczynia i rodzaju zamknięcia; • szybkości dyfuzji do tkanek roślinnych.

Niska rozpuszczalność i szybkość dyfuzji tlenu w wodzie oraz pożywkach w formie żeli są dodatkowymi czynnikami zmniejszającymi ilość O2 dostępnego dla roślin. Niskie jego stężenie powoduje zahamowanie oddychania i spowolnienie tempa wzrostu 3, a wysokie zapotrzebowanie na tlen wykazują kultury zawiesinowe oraz te przeznaczone do tuberyzacji. Zmniejszona ilość tlenu w hodowli ma jednak swoje korzyści, ponieważ ogranicza fotooddychanie, a także ma pozytywny wpływ na embriogenezę somatyczną i androgenezę. Zbyt duża ilość tlenu może mieć niekorzystne w skutkach wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS), co wymaga dodawania do pożywek antyoksydantów (kwasu askorbinowego, glutationu czy tiomocznika). Innym ważnym dla roślin składnikiem atmosfery hodowlanej jest tlenek węgla (IV), którego stężenie znacznie się waha w ciągu „dnia” i „nocy”. W jego przypadku potwierdzono, że suplementacja powoduje wspomaganie fotosyntezy, a kultury nieautotroficzne akumulują CO2 w swoich tkankach. Niskie stężenia doprowadzają do biosyntezy etylenu, natomiast wysokie stężenia dwutlenku węgla wywołują fotoinhibicję i zatrzymują działanie C2H4.

Rysunek 3. Roślinne kultury in vitro hodowane z suplementacją CO2.

Wilgotność – czyli stężenie wody lub pary wodnej w powietrzu we wnętrzu pojemników hodowlanych jest zazwyczaj bardzo wysoka i sięga 99%, przy czym w fitotronach ta wartość spada do ok. 70%. Kondensacja pary wodnej w naczyniach powoduje chłodzenie podstawy, co chroni przed przegrzaniem, jednak zbyt duża ilość pary wodnej w atmosferze wewnętrznej doprowadza do witryfikacji, zmian struktur mezofilu, aparatów szparkowych i kutykuli, a także nekrozy wierzchołków. Doprowadza to do sytuacji, w której eksplantaty nie mogą być od razu wprowadzane do środowiska, a konieczna jest stopniowa ich adaptacja do warunków ex vitro. Z kolei zbyt niska wilgotność powoduje utratę wody i wysychanie pożywki, a w konsekwencji zahamowanie wzrostu. Dodatkowymi, choć nie dotyczącymi każdej hodowli in vitro czynnikami wpływającymi na kultury roślinne są prąd elektryczny oraz fale dźwiękowe. Impulsy prądu o niskim natężeniu występują naturalnie w organizmach roślin, a te endogenne sygnały elektryczne odgrywają rolę w procesach rozwojowych. Poddawanie hodowli działaniu pola elektrycznego o niskim natężeniu i niskiej częstotliwości powoduje stymulację procesów wzrostu i regeneracji, syntezy metabolitów wtórnych oraz kontrolę procesów fizjologicznych. Impulsy elektryczne o wysokim napięciu stosuje się do przeprowadzenia elektroporacji (np. w transformacji 3

hipoksja, anoksja – zahamowanie wzrostu i pobierania składników odżywczych spowodowanych niedoborem tlenu.

chloroplastów), ale również do zainicjowania podziałów i regeneracji protoplastów czy stymulacji syntezy DNA i białek. Fale dźwiękowe z zakresu ultradźwięków mają znaczenie w: • transformacji genetycznej; • stymulacji regeneracji mikrouszkodzeń; • frakcjonowaniu zarodków somatycznych; • stymulacji syntezy metabolitów wtórnych; • sterylizacji eksplantatów. 3. Anatomia i morfologia roślin w kulturach in vitro. Głównymi organami dotkniętymi zmianami wynikającymi z warunków panujących w kulturze in vitro są struktury autotroficzne roślin. W mezofilu widoczna jest jedynie cienka warstwa miękiszu palisadowego, którego jest nieporównywalnie mniej do miękiszu gąbczastego, a ten dodatkowo jest rozdzielony dużymi przestrzeniami międzykomórkowymi. Widoczny jest proces witryfikacji, który skutkuje tworzeniem w obrębie komórek cienkich ścian komórkowych, cienkiej warstwy cytoplazmy i dużej wakuoli. Chloroplasty mają zaburzoną strukturę gran, czasem obserwowany jest brak ziaren skrobi. Kutykula również jest cieńsza, zachodzą zmiany struktury i składu włosków kutykularnych a sama epiderma zawiera mniej włosków liściowych. W przypadku aparatów szparkowych obserwowane są zmiany kształtu, rozmiaru oraz liczby, a część z nich staje się niefunkcjonalna – są stale otwarte i nie reagują na czynniki indukujące zamykanie szparek (np. ABA). Ściany komórkowe zawierają małą ilość kutyny, pektyn i celulozy, a orientacja jej mikrofibryli jest zaburzona. Pojawiają się złogi kalozy.

Rysunek 4. Porównanie przekroju zdrowych (A) oraz zwitryfikowanych (B) liści lawendy.

Rysunek 5. i 6. Porównanie powierzchni epidermy liści rośliny dzikiej (A i B) oraz hodowanej w kulturze in vitro (C i D).

4. Aklimatyzacja eksplantatów do warunków ex vitro. Warunki panujące poza naczyniami oraz pomieszczeniami hodowlanymi różnią się od nich wyższym natężeniem światła a także o wiele niższą wilgotnością. Rośliny z hodowli in vitro są więc narażone na spadki zawartości chlorofilu i wydajności fotosyntezy (często normalny proces fotosyntezy zachodzi dopiero w nowo wytworzonych liściach) oraz wyższą transpirację, która może powodować więdnięcie. W związku z tym, przed transferem roślin z kultur in vitro do warunków ex vitro należy przeprowadzić aklimatyzację, która może zachodzić w warunkach: • in vitro: o zwiększenie natężenia światła; o zmniejszenie wilgotności np. poprzez zmianę zamknięcia naczyń hodowlanych na bardziej przepuszczalne; o zwiększenie stężenia CO2; o stosowanie pożywek bez cukru; • ex vitro: o hodowla w szklarniach lub pod przykryciem; o zwiększenie stężenia CO2; o stosowanie kwasu abscysynowego (ABA) lub „antytranspiratnów” powodujące przejściowe lub stałe zamknięcie aparatów szparkowych....