03. Eigenschaften der DNA PDF

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Zusammenfassung Eigenschaften der DNA...

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03-Eigenschaften der DNA DNA absorbiert UV-Licht   

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Basen von DNA haben Aromatische Ringsysteme Absorptionsmax. 260nm und 280nm Wenn DNA-Probe mit UV-Licht und entsprechender Wellenlänge bestrahlt, wird Teil des Lichts "absorbiert" (ein Teil der eingestrahlten Energie wird zur Anregung der Ring-Elektronen verbraucht), die verbliebene Lichtmenge kann gemessen werden ("Spektralphotometrie") UV-Adsorption unabhängig von Molekülart o Bei aromatischem Ringsystem lässt sich Adsorption nachweisen o  auch Proteine absorbieren UV-Licht (wegen Aromatischen AS) o Wellenlänge bei Proteinen 280nm

Vergleich der Absorptionsspektren von Nukleinsäuren und Proteinen

Hitzedenaturierung der DNA    

DNA über kritischen Punkt erhitzt  vollständige Denaturierung von DNA-Molekül („schmelzen der DNA) Doppelstrang zu 2 Einzelsträngen DNA-Stränge durch H-Brücken und hydrophobe WW zwischen den gegenüberliegenden Basen zsmgehalten Beim Schmelzen  physikalische Eigenschaften ändern sich. Viskosität der DNA-Lösung verringert sich  andere UV-Absorption Denaturierung = kooperativer Prozess  Zusammenbruch von einem Teil des Systems führt zur Destabilisierung der Reststruktur  Vorgang beschleunigt sich

Schmelzkurve DNA

Erkennbar beim Verlauf von Schmelzkurve: o o o o o

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Nicht linear. Gemessen: UV-Absorption Je weiter Prozess fortgeschritten, desto höher Absorption Wendepunkt, wenn 50% der DNA aufgeschmolzen Tm = Schmelztemperatur  abhängig von Art und Konz. Von Ionen (Divalente Kationen (Mg2+, Mn2+) höheren Tm Einfluss, als monovalente Kationen (Na+,K+, Li+)) in DNA-Lösung und pH-Wert, C/G-Gehalt (mehr Einfluss als A/T, weil durch 3 statt 2 H-Brücken verbunden) der Probe DNA Desto höher Konz. Freier Kationen, desto mehr DNA liegt als Salz vor  Tm steigt

Hyperchromer Effekt o

Adsorption bei 260nm erhöht sich bei Denaturierung um 40% o  liegt an Aufhebung (durch Schmelzen) von (schwachen, aber messbaren) WW´s zwischen den Elektronen der Basen o Auch H-Brücken zwischen Basen werden gelöst o Bei einzelsträngiger DNA: Nukleotide als würden sie frei in Lösung liegen (egal, dass untereinander noch über Zucker verbunden) o  Basen der ssDNA (einzelsträngige) absorbieren mehr Licht, als die von dsDNA  „Hyperchromizität“ oder „hyperchromer Effekt“

Renaturierung von DNA (Annealing) o o o o

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Einzelstränge wieder in Doppelstränge In denaturierter DNA-Lösung (eine Art DNA) gibt es „komplementäre“ (gehören zueinander) DNA-Stränge  können wieder zu dsDNA gemacht werden Kooperativer Vorgang Zueinander passende Stellenmüssen sich über Brow´sche Molekularbewegung finden und Basen müssen sich paaren, wenn dann benachbarte Sequenzen auch passenn  Vorgang setzt sich auf beiden Seiten fort.  je länger entstandener dsDNA-Bereich, desto wahrscheinlicher, dass benachbarte Sequenzen auch passen  Beschleunigung von Prozess Damit Prozess ablaufen kann  Temperatur, die Brow´sche Molekularbewegung zulässt, aber nicht so hoch, dass Sequenzen sich direkt wieder trennen und so, dass kinetishce Energie ausreicht, um fehl Paarungen zu trennen Vollständige Renaturierung  Inkubation bei 25°C unter Tm Wenn Lösung schnell abgekühlt  DNA bleibt denaturiert

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Je komplexer Genom, desto schwerer ist Renaturierung (Geschwindigkeit abhängig von DNALänge)

Hybridisierung von Nukleinsäuren o o

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Re- und Denaturierung für gentechnische Methoden, bei denen vergleichbare Sequenzen nachgewiesen werden z.B. Blots, PCR, Microrarrays Grundprinzip: o DNA wird geschmolzen und mit einer andern (denaturierten) DNA oder RNA vermischt o  „Hybridisierung“ (nicht Denaturierung), weil Doppelstrang dann aus 2 versch. Sachen o Egal ob RNA und DNA, oder DNA und DNA. Wenn Hybridisierung, beide Nukleinsäuren einander homolog (Gleiche o. sehr ähnliche Sequenz) Nachweis Renaturierung: o Sonde (DNA-Stück bekannter Sequenz) wird markiert (mit Farbstoff o. radioaktiv)  erfolgreiche Hybridisierung kann erkannt werden

Abbildung: o

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2 versch. DNA´s (Sonde und Probe) werden denaturiert, zusammengebracht und abgekühlt Wenn homologe Bereiche  Sonde (blau) lagert sich an Probe-DNA (rot) Wenn homologer Bereich lang genug  stabiles Hybrid bildet sich  kann nachgewiesen werden Es kann nicht zu vollständiger Wiederherstellung von originaler dsDNA kommen (keine 100% homologie)

Superspiralisierung der DNA o o

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„Supercoils“ o. „Superhelices“ Wie, wenn Haushaltsgummi zwischen Fingern gezwirbelt  Superspiralen auftreten weiter zusätzlicher Schlaufen, die vorher nicht da waren DNA-Supercolis, wenn DNA zum Ring geschlossen wird (meisten Bakterien Ringförmige DNA  Plasmid) Problem: Enden der DNA-Einzelstränge nicht glat, sondern verdreht  kein sauberer Ringschluss  Winkelversatz wird durch Verdrehung um Längenachse ausgeglichen  Spannung nimmt zu (topologischer Stress) Topologischer Stress auch, wenn Stränge von Doppelhelix getrennt werden o Passiert ständig bei DNA Replikation o. Transkription Topologischer Stress kann aber auch bei linearer DNA auftreten, wenn auf kurzer Strecke deutliche Verdrehung der Längsachse o Bsp. Beim Aufwickeln der DNA um den Histon-Core bei der Bildung der Nukleosomen Unterschiedliche DNA-Formen siehe Bild  „Konformationen“ o Linear, offenkettig „open circular“und superspiralisiert “Supercoiled” (normaler Zustand, verbraucht am wenigsten Platz) o Konformationen können ineinander überführt werden o Zustandekommen:  Bei Präparation nicht sauber gearbeitet  kann bei Plasmiden zu Einzelstrangbrüchen kommen. Supercoil wird zu offenkettiger Form  Kommt es zu Doppelstrangbruch  lineare Form entsteht  Supercoil in „open circle“ = kompliziert  Lösen von Phosphodiesterbindung zwischen 2 Nukleotiden auf einem Strang („nick“ erzeugen)  man erhält einen intakten Strang und einen mit je einem 3` OH- und 5`-Phosphatende  Intakter Strang: chemische Bindungen sind frei drehbar  geknickter Strang kann frei um intakten rotieren  Winkelversatz kein Hindernis

 topologische Spannung wird aufgehoben supercoil wird aufgelöst  entspanntes, ringförmiges DNA-Molekül (mit Einzelstrangbruch)

Kontrolle der Topologie durch Enzyme o

In vivo: Auflösung der supercolis erforderlich bei Replikation oder Kompaktierung o Zuständige Enzyme: Topoisomerasen (2 Haupttypen)  katalysieren die Entspannung einer Superspiralisierung der DNA  Typ 1  Sorgen für Einführung transienter Einzelstrangbrüche „nicking-closing enzymes“  setzen erst einen nick und schließen ihn auch wieder  Abbildung: Topoisomerase 1 bindet an DNA, setzt Nick und bindet vorübergehend an geknickten Strang. Durch Nick ist Rotation um geknickten Strang möglich. Wenn topologische Spannung aufgehoben, wird Nick wieder geschlossen.  Typ 2  Einführung transienter Doppelstrangbrüche  Bsp. Gyrase (in Bakterien), die Superspiralisierung aufhebt, welche bei Strangtrennung (Replikation) entsteht.  dazu muss Doppelstrangbruch erzeugt werden.  Klassische Antibiotika wie z.B Novobiocin oder Levofloxacin  Gyrase-Hemmer...