Enzyme Funktion und Eigenschaften PDF

Preview

Summary

Download Enzyme Funktion und Eigenschaften PDF

Description

Enzyme Manche chemischen Reaktionen laufen nicht freiwillig ab, obwohl sie eigentlich exergonisch sind (siehe hierzu: Thermodynamik). Grund hierfür ist meistens, dass die Reaktionen eine hohe Aktivierungsenergie haben, die überwunden werden muss. Soll die Reaktion dennoch ablaufen, dann muss die Reaktion katalysiert werden: Hierzu wird ein Stoff, der sog. Katalysator, zum Edukt gegeben, der mit dem Edukt einen Katalysator-Edukt-Komplex bildet, für den die Aktivierungsenergie deutlich niedriger ist. Ein Katalysator wird bei der Reaktion nicht verbraucht, sondern kann im Laufe der Zeit beliebig viel Edukt umsetzen. In Zellen werden chemische Reaktionen von Biokatalysatoren, den sog. Enzymen, katalysiert. Dabei handelt es sich meist um Proteine, die über ein aktives Zentrum verfügen, an dem ein Substrat gebunden und umgesetzt werden kann. Sie kommen in allen Kompartimenten der Zelle vor und sind an nahezu allen Stoffwechselprozessen beteiligt. Enzyme sind sehr spezifisch im Hinblick auf das Substrat, das sie umsetzen, und die Reaktion, die sie katalysieren. Darüber hinaus lassen sich diese Enzyme auf vielfältige Weise regulieren – und mit ihnen der gesamte Zellstoffwechsel. Die Regulierungsstrategien reichen dabei von der Beeinflussung der Transkription und Translation der Enzyme (sehr langsam) bis hin zu schnellen aktivitätsverändernden Konformationsänderungen der Enzyme, die durch bestimmte Effektoren vermittelt werden. Darüber hinaus gibt es verschiedene Möglichkeiten, Enzyme in ihrer Aktivität langfristig oder zeitweise zu hemmen.

Grundlagen: Katalyse: Die Katalyse dient bei chemischen Reaktionen dazu, einen alternativen Reaktionsweg zu eröffnen. Dies kann sinnvoll sein, wenn eine Reaktion zwar energetisch günstig, aber dennoch kinetisch gehemmt ist (also nahezu unendlich langsam abläuft). o Funktion: Macht eine Reaktion energetisch günstiger, sodass sie leichter ablaufen kann. Katalysator: Stoff, der bei einer katalytischen Reaktion den Edukten zugesetzt wird und den alternativen Reaktionsweg ermöglicht. o Beispiel: Enzym; Ein Enzym ist ein Protein, das als Katalysator für eine Reaktion in biochemischen Systemen wirkt. Enzyme werden deshalb auch als „Biokatalysatoren“ bezeichnet Chemische Reaktionskopplung: Verbindung einer energetisch ungünstigen Reaktion mit einem energieliefernden Prozess • Funktion: Sorgt dafür, dass eine ungünstige Reaktion dennoch ablaufen kann = Energietransformation. • Kopplungspartner der Reaktionen o Chemiosmotische Kopplung: Konzentrationsgradient über eine Membran o Chemische Kopplung: Energieträgermoleküle

Verbindungen als Energieträgermoleküle: „Energiereiche“ Verbindungen sind kleine Moleküle, auf die reversibel funktionelle Gruppen übertragen werden können, wodurch sie zu Energieträgern werden. Die Abspaltungsreaktion der funktionellen Gruppe (i.d.R. Phosphatgruppen) vom Energieträgermolekül erfolgt mittels Wasser, sie setzt eine große Menge Energie frei. Der wichtigste Energieträger ist das ATP. Details zur ATPSynthese siehe: Atmungskette.

Wichtig!! Energieträgermoleküle sind keine Energiespeicher! Energiespeicher müssen eine besonders hohe Energiedichte haben. Fettsäuren bspw. haben einen Energiegehalt von ca. 37KJ/g, wohingegen in 1mol (= 507g) ATP nur 31KJ/mol Energie gespeichert sind.

Enzyme - Definition und Aufbau Enzyme sind Moleküle, die Reaktionen in biochemischen Systemen katalysieren, sie sind also „Biokatalysatoren“. Zu den Enzymen gehören fast ausschließlich Proteine, lediglich die Ribozyme stellen eine Ausnahme dar. Die Zahl der Proteinenzyme, die auch Nichtproteinbestandteile aufweisen (die sog. Holoenzyme), ist jedoch groß. Aufbau Zum allgemeinen Aufbau von Proteinen siehe: Aminosäuren und Proteine. • Aktives Zentrum o Bereich des Enzyms, an dem die Reaktion stattfindet o Oft eine Tasche oder Höhle im Inneren des Proteins • Regulatorisches Zentrum o Manche Enzyme verfügen neben dem aktiven Zentrum über ein weiteres Bindungszentrum, das der Regulation der Enzymaktivität dient Arten • Ribozyme (siehe hierzu: RNA: Struktur und Eigenschaften) • Reine Proteinenzyme • Holoenzyme: Bestehen immer aus Apoenzym und Cofaktor o Apoenzym: Proteinteil des Enzyms o Cofaktor (auch Coenzym): Nichtproteinteil des Enzyms ▪ Prosthetische Gruppe ▪ Definition: Dauerhaft kovalent ans Protein gebundenes organisches Molekül ▪ Beispiele ▪ Biotin (Carboxylasen) ▪ Häm (Cytochrom c) ▪ Flavin (Flavoproteine) ▪ Metallion ▪ Definition: An der katalytischen Reaktion beteiligtes, koordinativ gebundenes Metallion im aktiven Zentrum ▪ Beispiele: Fe3+, Cu2+, Ni2+, Zn2+, … ▪ Cosubstrat: Cofaktoren, die nach der katalytischen Reaktion wieder vom Enzym dissoziieren Enzymdiagnostik Da Enzyme an allen Stoffwechselprozessen beteiligt sind, kann man anhand ihrer Verteilung und der vorhandenen Menge überprüfen, ob der jeweilige Stoffwechselprozess im Körper regulär funktioniert. Dies macht man sich heute in einer großen Zahl enzymdiagnostischer Verfahren zunutze, besonders innerhalb der Leber- und Herzdiagnostik. Bspw. weist eine erhöhte Konzentration von Kreatinkinase (Enzym des Phosphokreatinstoffwechsels. Die Kreatinkinase katalysiert als Enzym die Umwandlung von Kreatin und ATP zu Phosphokreatin (= Kreatinphosphat) und ADP als auch die Gegenreaktion.) im Blut auf einen Herzinfarkt hin, da das Sterben myokardialer Zellen zur Freisetzung von Kreatinkinase führt, die noch bis zu 4 h im Serum nachgewiesen werden kann.

Enzymklassifikation Die Endung „-ase“ im Namen weist bereits darauf hin, dass es sich bei einem Molekül um ein Enzym handelt. Darüber hinaus gibt es aber auch eine international gültige Klassifikation von Enzymen nach ihrer jeweiligen Funktion oder ihrem Substrat: Die sechs Hauptklassen der Enzyme Klasse Name Katalysierte Reaktion Beispiele • (De-) Hydrogenasen Redoxreaktionen • Oxidasen 1 Oxidoreduktasen • Oxygenasen • Kinasen Übertragen funktionelle Gruppen von einem 2 Transferasen • Aminotransferasen auf ein anderes Substrat • Glycosyltransferasen 3

Hydrolasen

Hydrolytische Spaltung kovalenter Bindungen

• •

Phosphatasen Esterasen

4

Lyasen

Bildung und Spaltung aller kovalenten Bindungen, die nicht in die Klassen 1 und 3 fallen

• •

Aldolasen Fumarase

5

Isomerasen

Umwandlung von Substraten in ihre Isomere

• •

Mutasen Epimerasen

6

Ligasen

Knüpfung kovalenter Bindungen und Kopplung der Reaktion an die Hydrolyse eines Energieträgermoleküls (s.o.)

• •

Carboxylasen DNA-Ligase

Die Endung „-ase“ im Namen weist bereits darauf hin, dass es sich bei einem Molekül um ein Enzym handelt! Isoenzyme katalysieren die gleiche Reaktion, auch wenn sie strukturell verschieden sind!

(1) Reduktion • Definition: Aufnahme von Elektronen • Beispiel: Cu2+ + 2 e- → Cu0 • Oxidationszahl: Sinkt (bzw. wird stärker negativ), wenn ein Stoff reduziert wird • Reduktionsmittel: Ein Stoff, der andere Stoffe reduziert und dabei Selber oxidiert wird Oxidation • Definition: Abgabe von Elektronen • Beispiel: Fe0 → Fe3+ + 3 e• Oxidationszahl: Steigt, wenn ein Stoff oxidiert wird • Oxidationsmittel: Ein Stoff, der andere Stoffe oxidiert und dabei Selber reduziert wird

(2) Funktionelle Gruppen sind Atomgruppen, die in Kohlenwasserstoffen an die Stelle der Wasserstoffatome treten und das Reaktionsverhalten der sie tragenden Verbindung maßgeblich beeinflussen. Aufgrund ihrer ähnlichen Eigenschaften werden die Kohlenwasserstoffe anhand ihrer funktionellen Gruppen zu verschiedenen Stoffklassen zusammengefasst

Die wichtigsten funktionellen Gruppen im Überblick Name der funktionellen Gruppe

Strukturformel Stoffklasse

Nomenklatur • • •

Priorität

"-carbonsäure" 1 "-säure" "Carboxy-" "R-säure-R'2 ester" "-al" "-carbaldehyd" 3 "Formyl-"

Carboxylgruppe

•

RCOOH'

•

Carbonsäuren

Ester

•

RCOOR'

•

Carbonsäureester

•

•

Aldehyde

•

R-COH

• • •

•

Ketone

•

R-CO-R'

• • •

Hydroxylgruppe

•

R-OH

• •

Alkohole Phenole

• •

Thiolgruppe

•

R-SH

•

Thiole

• • •

Aminogruppe

•

NR3

•

Amine

• •

"-thiol" "-mercaptan" "Sulfanyl-" "-amin" "Amino-"

Ethergruppe

•

R-O-R'

•

Ether

• •

"-oxy-" "-ether"

8

•

R-S-R'

•

Thioether

• •

"-thio-" "-sulfid"

9

Carbonylgruppe

Thioethergruppe

"-on" "Oxo-" "Keto-" "Hydroxy-" "-ol"

4 5 6 7

(3) Hydrolyse Zur Kategorie Hydrolyse gehören alle Reaktionen, bei denen ein Molekül durch ein Wassermolekül gespalten wird. • Allgemeine Reaktionsgleichung: A-B + H2O ⇄ A-OH + B-H (5) Je mehr Atome ein Molekül hat, desto mehr Möglichkeiten gibt es diese miteinander zu verknüpfen. Schon bei verhältnismäßig kleinen Molekülen ist daher die Summenformel keine eindeutige Angabe mehr dafür, was für ein Molekül vorliegt. Moleküle mit gleicher Summenformel, aber unterschiedlicher Struktur nennt man Isomere. Man unterscheidet dabei verschiedene Arten von Isomeren:

Biokatalyse Biokatalysatoren beschleunigen Reaktionen in biochemischen Systemen, indem sie die Aktivierungsenergie herabsetzen oder alternative Reaktionswege ermöglichen. Biokatalysatoren sind enorm effektiv und synthetischen Katalysatoren im Hinblick auf Selektivität und Aktivität bei weitem überlegen, da sie sich evolutionär genau an ihr Substrat und ihre Reaktion angepasst haben.

Enzymspezifität Eine katalytische Umsetzung in lebenden Zellen ist eine Katalyse unter erschwerten Bedingungen: Es liegt eine Vielzahl von Stoffen gleichzeitig nebeneinander vor, die sich z.T. sehr ähnlich sind. Dennoch muss gewährleistet werden, dass ein Enzym das richtige Substrat umsetzt und dabei ausschließlich das gewünschte Produkt entsteht, da die Produktion anderer Substanzen sowohl toxisch sein kann als auch den fein abgestimmten Stoffwechsel der Zelle durcheinanderbringen würde. Substratspezifität •

Definition: Enzyme erkennen selektiv „ihr“ Substrat. Schlüssel-Schloss-Prinzip

•

Ursache: Komplementäre Strukturen von Enzym und Substrat (Sowohl hinsichtlich der räumlichen Struktur als auch der Ladungsverteilung)

Reaktionsspezifität •

Definition: Enzyme setzen ein Substrat nur auf eine bestimmte Weise um.

•

Ursache: Das Substrat wird im aktiven Zentrum immer gleich ausgerichtet, (Mittels schwacher Wechselwirkungen wie ionischen oder hydrophoben Wechselwirkungen, Van-derWaals-Kräften oder Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Substrat und Enzym) sodass die beteiligte funktionelle Gruppe des Enzyms immer gleich angreifen kann

Stereospezifität •

Definition: Eine Reaktion, bei der nur eines von mehreren möglichen Stereoisomeren entsteht (Details zur Isomerie siehe: Grundlagen der Organischen Chemie) Dahingegen sind Reaktionen, bei denen bevorzugt eines von mehreren Stereoisomeren entsteht, nur stereoselektiv.

•

Ursache: Proteine sind aus chiralen Aminosäuren aufgebaut und daher selber chiral

Katalytische Enzymaktivität Um die katalytische Aktivität eines Enzyms anzugeben, gibt es verschiedene Bezugsgrößen, die sich auf das Volumen, die Masse, die Stoffmenge oder die Stoffmenge unter Berücksichtigung der Zahl der aktiven Zentren eines Enzyms beziehen. Die SI-Einheit der Enzymaktivität ist das „Katal“ (kat; 1kat = die Menge Enzym, die 1mol Substrat in 1s unter definierten Bedingungen in Produkt umwandelt). Auch die historische Einheit „Unit“ (U; 1U = die Menge Enzym, die 1μmol Substrat in 1min unter Standardbedingungen in Produkt umwandelt) ist noch in einigen Arbeiten zu finden. •

Volumenaktivität: Enzymaktivität pro Volumen o

•

Spezifische katalytische Aktivität: Aktivität bezogen auf die Masse des Enzyms o

•

Einheit: kat/kg bzw. U/mg

Molare katalytische Aktivität: Aktivität bezogen auf die Stoffmenge des Enzyms o

•

Einheit: kat/L bzw. U/ml

Einheit: kat/mol

Wechselzahl: Molare katalytische Aktivität bezogen auf die Zahl der aktiven Zentren des Enzyms o

Wird in der biochemischen Praxis sehr oft verwendet

o

Ist auch unter dem englischen Begriff „turn-Over-rate“ bekannt

Angaben zu Enzymen werden nicht immer unter Standardbedingungen gemacht: Als Bezugstemperatur verwendet man im Labor oft 25°C oder 30°C, wohingegen klinische Untersuchungen fast ausschließlich 37°C verwenden!

Abhängigkeit von physikalischen Faktoren Die Aktivität eines Enzyms ist von äußeren Faktoren abhängig. •

Temperatur o

Verhalten: Innerhalb eines kleinen Schwankungsbereichs steigt die Enzymaktivität mit der Temperatur, bei Überschreiten des Optimums sinkt die Enzymaktivität drastisch. ▪

o •

•

•

Grund: Denaturierung der Enzyme bei zu hoher Temperatur

Optimum: Temperatur, bei der die höchste Aktivität des Enzyms beobachtet wird

pH-Wert o

Verhalten: Die meisten Proteine zeigen ein Aktivitätsmaximum zwischen pH 4 und pH 9. (Es gibt Ausnahmen wie das Pepsin, das im sauren Milieu des Magens arbeitet (ca. pH 1))

o

Gründe ▪

Reversible Dissoziation und Ionisierung von funktionellen Gruppen des Enzyms

▪

Reversible Dissoziation und Ionisierung des Substrats

▪

Denaturierung des Enzyms bei zu extremem pH

Salzkonzentration o

Strukturelle Voraussetzung: Eine bestimmte Menge an Salzen kann nötig sein, um die räumliche Struktur oder sogar die chemische Funktion von Proteinen zu stabilisieren (Toleranzbereich).

o

Grund: Denaturierung der Enzyme außerhalb des Toleranzbereichs

Oxidative Umgebung o

Einfluss: Oxidationsmittel (Stoff, der andere Stoffe oxidiert und dabei selbst reduziert wird, z.B. Sauerstoff (O2). wie Luftsauerstoff und Übergangs Metallionen in der Umgebung des Enzyms können das Enzym inaktivieren (oder gezielt aktivieren)

o

Grund: Veränderung der räumlichen Struktur eines Enzyms oder seiner Stabilität

o

Beispiel: Sulfhydrylgruppen des Enzyms, die an der Katalyse Reaktion beteiligt sind, werden zu Disulfidbrücken oxidiert, wodurch das Enzym seine Konfirmation ändert.

Enzymkinetik Die Kinetik beschreibt die Geschwindigkeit chemischer Reaktionen und Prozesse. Bei einer enzymatischen Reaktion hängt die Geschwindigkeit sowohl von der Menge des vorhandenen Enzyms als auch von der Konzentration des Substrats ab. Wird die Konzentration des Enzyms konstant gehalten, dann zeigt die Geschwindigkeit in Abhängigkeit von der Substratkonzentration einen Sättigungsverlauf. Michaelis-Menten-Modell Enzymkatalysierte Reaktionen haben eine besondere Kinetik, die man mit Hilfe des MichaelisMenten-Modell beschreibt. Dabei geht man von der Bildung eines Enzym-Substrat-Komplexes während der Reaktion aus:

Dieser Enzym-Substrat-Komplex (ES) steht mit den anderen Komponenten des Reaktionsgemischs (dem Enzym (E), dem Substrat (S) und dem Produkt (P)) in einem Fließgleichgewicht. Ein Fließgleichgewicht ist ein Zustand, bei dem ständige Substanzen in gleichem Maße zuströmen wie abfließen. Dies ist eine Konsequenz daraus, dass Zellen offene Systeme sind, die mit ihrer Umgebung im ständigen Austausch stehen. •

•

•

•

•

Michaelis-Menten-Gleichung: v = vmax × c(S) / (KM + c(S)) o v = Reaktionsgeschwindigkeit, vmax = maximale Geschwindigkeit der Reaktion (bei großem Überschuss an Substrat gegenüber dem Enzym), c(S) = Konzentration des Substrats im Gemisch, KM = Michaelis-Menten-Konstante Michaelis-Menten-Konstante: KM = (k+22 + k−1) / k+11 o Einheit: mol/L o KM = Michaelis-Menten-Konstante, k+22 = Geschwindigkeitskonstante der Reaktion ES → E + P, k−1 = Geschwindigkeitskonstante der Reaktion ES → E + S, k+11= Geschwindigkeitskonstante der Reaktion E+S → ES o Entspricht der Substratkonzentration, bei der die Hälfte der aktiven Zentren der an der Reaktion beteiligten Enzyme von Substrat besetzt sind o Entspricht der Substratkonzentration, bei der die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion halb-maximal ist Maximale Geschwindigkeit: vmax = k+22 × c(ET) o vmax = maximale Geschwindigkeit, k+22 = Geschwindigkeitskonstante der Reaktion ES → E + P, c(ET) = Gesamtkonzentration des Enzyms im Gemisch o vmax ist definitionsgemäß die Enzymkonzentration, die benötigt wird, um 1Mol Substrat in 1s umzusetzen und wird daher in M/s angegeben Geschwindigkeitskonstante k+22: Wechselzahl o k+22 = Geschwindigkeitskonstante der Reaktion ES → E + P o Zahl der Substratmoleküle, die pro Enzym und Sekunde zu Produkt umgesetzt werden Maximale katalytische Aktivität: k+22/kM o Katalytische Wirksamkeit wird begrenzt durch das diffusionsbedingte Aufeinandertreffen von Enzym und Substrat. o In wässriger Lösung ca. 109×1/sM

•

•

•

•

• • •

•

• •

Die Reaktion E + S → ES ist eine Reaktion zweiter Ordnung (siehe: Reaktionsordnung), daher gilt für die Geschwindigkeit der Reaktion o v = k1 × [E] × [S] Gleichzeitig laufen aber auch zwei Reaktionen 1. Ordnung ab, die die Konzentration des Enzym-Substratkomplexes verringern: o ES → E + S mit der Geschwindigkeit v = k−1 × [ES] o ES → E + P mit der Geschwindigkeit v = k+22 × [ES] Im Gleichgewichtszustand laufen die Reaktionen, die zur Bildung von ES führen mit der gleichen Geschwindigkeit, wie die Reaktionen, die zum Abbau von ES führen: o 0 = (k1 × [E] × [S]) − (k−1 × [ES]) − (k+22 × [ES]) Weil die Konzentration von E unbekannt ist und sich auch nicht einfach messen lässt, versucht man sie in der Gleichung zu ersetzen und führt zunächst die Gesamtkonzentration des Enzyms E0 ein: [E]0 = [E] + [ES] bzw. [E] = [E0] – [ES] o ⇔ 0 = (k1 × ([E0] – [ES]) × [S]) − (k−1 × [ES]) − (k+22 × [ES]) Ausmultiplizieren der Klammer: o ⇔ 0 = (k1 × [E0] × [S]) – (k1 × [ES] × [S]) − (k−1 × [ES]) − (k+22 × [ES]) Ausklammern von – [ES]: o ⇔ 0 = (k1 × [E0] × [S]) – [ES] × (k1 × [S] + k−1 + k+22) [ES] auf eine Seite bringen: o k1 × [E0] × [S] = [ES] × (k1 × [S] − k−1 − k+22) o ⇔ (k1 × [E0] × [S]) / (k1 × [S] − k−1 − k+22) = [ES] o ⇔ ([E0] × [S]) / (((k−1 + k+22) /k1) + [S]) = [ES] Für den Term (k−1 + k+22) /k1 wird nun die Konstante KM, die Michaelis-Menten-Konstante, eingeführt o ⇔ ([E0] × [S]) / (kM + [S]) = [ES] Setzt man nun die Anfangsgeschwindigkeit v0 = k2 × [ES] => [ES] = v0 / k2 ein, dann folgt o v0 = (k2 × [E0] × [S]) /(kM+[S]) Weil k2 × [E0] die maximale Geschwindigkeit vmax der Reaktion ist, kann auch dies ersetzt werden: o ⇔ v0 = (vmax × [S]) /(kM+[S])

Lineweaver-Burk-Plot Zur praktischen Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante KM und der maximalen Geschwindigkeit vmax ist die von Michaelis und Menten vorgeschlagene Auftragung der Geschwindigkeit gegen die Substratkonzentration wenig geeignet. Stattdessen wird eine lineare Auftragung gewählt, die man nach ihren Entwicklern den Lineweaver-Burk-Plot nennt:

•

Graphische Darstellung o

Formel der Geraden: 1/v = 1/vmax + KM/vmax × 1/c(S) ▪

o

Die Steigung der Geraden ist also KM/vmax

Wichtige Punkte ▪

Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse: Hier kann 1/vma...