04 Acidos nucleicos - Composición, tipos, estructura, función, localización, desnaturalizan del ADN PDF

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Composición, tipos, estructura, función, localización, desnaturalizan del ADN...

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INTRODUCCIÓN A LA BIOLOGÍA

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UNIDAD 2: LAS BASES QUÍMICAS DE LA VIDA Parte III

ÁCIDOS NUCLEICOS Mononucleótidos. Composición. Tipos en ADN y ARN. Otras funciones. Polinucleótidos. Estructura de los ácidos nucleicos. ADN: modelo de Watson y Crick. ARN, tipos. Funciones de los ácidos nucleicos. Replicación. Transcripción. Traducción. Código genético. Localización de los ácidos nucleicos en virus, células procarióticas y eucarióticas. Mutaciones. Desnaturalización, renaturalización e hidrólisis de ácidos nucleicos. Estudios de fragmentación y secuenciación de ADN. Tecnología del ADN.

Material elaborado por Prof. Estela Pedrazzini y Graciela Zanassi, según la siguiente Bibliografía: Alberts, B., A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts & P. Walter, Biología Molecular de la Célula, 4ª Edición (traducido de la 4ª edición inglesa, 2002), Ediciones Omega S.A., Barcelona, 2004. Becker, W; L Kleinsmith y J Hardin: El Mundo de la Célula, 6ª edición (traducido de la 6ª edición inglesa, 2006), Pearson Educación, Madrid, 2007. a Nelson, D.L., M.M. Cox, Principios de Bioquímica de Lehninger; 4 Edición (traducido de la 2ª edición inglesa, 2004). Ediciones Omega, Barcelona, 2005. Raven, P.H., Johnson, G.B.: Biology, 3rd Ed., Mosby Year Book, St Louis, 1992. Lodish, H., A. Berk, S.L. Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore, J. Darnell: Biología Celular y Molecular, 4ª edición (traducido de la 4ª edición inglesa, 2000), Editorial Médica Panamericana, España, 2002. Bibliografía temas específicos: Del Vecchio, V. et al. The genome sequence of the facultative intracellular pathogen Brucella melitensis. Proc. Natl. Acad. Sci., 99, 443-448, 2002. Egan, E., M. Waldor. Distinct Replication Requirements for the Two Vibrio cholerae Chromosomes. Cell, 114, 521–530, 2003.

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Ácidos Nucleicos

ÁCIDOS NUCLEICOS En las células se encuentran dos variedades de ácidos nucleicos: ácidos ribonucleicos: ARN y ácidos desoxirribonucleicos: ADN. Son reservorios de información de las células. El ADN compone los genes, que contienen las instrucciones para la producción de todas las proteínas que el organismo necesita para cumplir todas sus funciones. Es la única macromolécula capaz de producir copias precisas de sí misma, por lo que la información de los genes que posee una célula puede ser transmitida a las células hijas, o la de un organismo a sus descendientes; por eso se dice que el ADN constituye el material hereditario de las células. El otro tipo de ácido nucleico, el ARN es utilizado por las células para leer la información codificada en el ADN y para usar esa información para fabricar sus proteínas. Hay tres tipos principales de ARN que actúan en el proceso de síntesis de proteínas: ARN mensajero, ARN de transferencia y ARN ribosómico. Existen otros diversos ARN pequeños que cumplen diferentes funciones en la célula. Al igual que las proteínas, los ácidos nucleicos son grandes y complejas moléculas. Fueron aislados por primera vez por Miescher en 1868, a partir del núcleo de los leucocitos del pus; su nombre se origina del hecho de que cuando se identificaron se observó que eran ácidos, además de pertenecer al núcleo celular. Los ácidos nucleicos son biopolímeros, cuyos monómeros son los mononucleótidos, que están constituidos por tres moléculas que unidas forman la subunidad que se repite.

Mononucleótidos Cada mononucleótido está compuesto por: 1) un azúcar de cinco carbonos, 2) una base orgánica nitrogenada, ya sea derivada de una purina, de doble anillo, o de una pirimidina, de anillo simple y 3) un grupo fosfato. La molécula resultante de la unión de la pentosa y la base nitrogenada se denomina nucleósido. La unión al mismo de un grupo fosfato en enlace éster al OH en posición 5’ de la pentosa forma el nucleótido. Las pentosas son la D-ribosa en el ARN y la 2-desoxi-D-ribosa en el ADN, ambas se encuentran en su forma -furanósica. Los átomos de carbono se numeran añadiéndoles un signo prima (‘) para distinguirlos de los átomos numerados de las bases nitrogenadas. 5' CH2 O

HO 4'

H 3' OH

4'

1'

H

H

5' CH2 O

HO

OH

H

H

H

2'

3'

D-ribosa

1'

H H 2' H

OH

OH

OH

2-desoxi-D-ribosa

Tanto el ADN como el ARN contienen dos bases púricas principales, la adenina (A) y la guanina (G), y dos pirimídicas, la citosina (C) en ambos, mientras que la segunda difiere: es la timina (T) en el ADN y el uracilo (U) en el ARN. Adenina (A)

Guanina (G) O

N NH 2 6 1

6

7

N

5

H H

N

N7

5

N N 1

8

8

PURINAS 2

N

4

N N

2 9

H2 N

3

N

N N9

4

3

H H

H

Citosina(C)

Timina (T)

Uracilo (U) O

O

NH 2

PIRIMIDINAS

H

5

N

N

H

3

2

N H

1

4

N

3N

5

3 6

O O

CH 3

4

4

5 6

6

O O

2

N H

1

O

2

N

1

H

Además de esas bases, 4 en el ADN y 4 en el ARN, que dan 4 tipos de monómeros para cada uno de ellos, existen otras bases secundarias. En el ADN las más comunes son las formas metiladas de las principales: ej. 5-metilcitosina en el ADN de animales superiores; en algunos ADN de virus pueden estar hidroximetiladas o glicosiladas. Esas bases poco comunes sirven como señales específicas para la regulación o la protección de la

información genética. En los ARN, en especial en el ARNt, se encuentran también otros tipos de bases, como hipoxantina (púrica), pseudouracilo y tiouracilo (pirimídicas). 2

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Ácidos Nucleicos

La base está unida covalentemente a través de un enlace N-glicosídico al carbono 1’ de la pentosa; se une el H del N1 en las pirimidinas o el del N9 en las purinas, al OH del C 1’ de la pentosa. Los nombres de los 4 ribonucleósidos del ARN son: adenosina, guanosina, citidina, uridina y los de los 4 desoxirribonucleósidos: desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxicitidina y desoxitimidina. N H2 Adenina

P

1

C 6

5

N 7 8 C 9 N

C

HC 2 3 4 C N 5' CH 2 O

O -O

N

O

O-

4'

H

H

H

Fosfato

1'

H 2'

3' OH

OH

Ribosa

Adenosina 5'- monofosfato

Los correspondientes ribonucleótidos se nombran ribonucleósido 5’-monofosfato, como por ej. la adenosina 5’-monofosfato: AMP, y los otros son: GMP, CMP y UMP. Los desoxirribonucleótidos son entonces: dAMP o desoxiadenosina 5’-monofosfato, dGMP, dCMP y dTMP. Adenosina 5'-trifosfato N H2 Adenina

O-

O O-

P O-

O

P O

O O

P

O

O-

C N 1 6 5C

N 7 8 C 9 N

HC 2 3 4 C N 5' CH2 O 4'

H

H 3' OH

H H 2' OH

1'

Ribosa

NMP NDP NTP

Los nucleótidos pueden ser mono-, di- o tri-fosfato según se unan al C5’ de la pentosa uno, dos o tres grupos fosfato.

Los nucleósidos trifosfato son los precursores activados que van a participar en la síntesis de ADN y ARN. Los mononucleótidos constituyen las subunidades básicas de los ácidos nucleicos, pero además, cumplen otras diversas funciones biológicas : transportadores de energía, componentes de cofactores enzimáticos y mensajeros químicos. Las células poseen cantidades significativas de nucleótidos libres, que provienen de la degradación de los ácidos nucleicos o de reacciones de síntesis. Transportadores de energía: Los nucleósidos trifosfato se utilizan como fuente de energía química para impulsar una amplia variedad de trabajos que realizan las células. El ATP es el más ampliamente usado, aunque hay reacciones específicas que emplean UTP, GTP y CTP. La hidrólisis de los NTP y dNTP es una reacción que libera energía. El enlace entre la pentosa y el fosfato es del tipo éster, los otros enlaces entre fosfatos son anhídridos del ácido fosfórico; son enlaces "ricos en energía", que se señalan por el símbolo P. Estos enlaces liberan una gran cantidad de energía cuando se

someten a hidrólisis; liberan el doble de energía que la del enlace éster.

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Ácidos Nucleicos

La mayor parte de la energía química de las células se almacena en enlaces de fosfato ricos en energía del ATP. El fosfato terminal se añade utilizando la energía de la oxidación de los alimentos y luego al hidrolizarse, la energía que se libera es biológicamente utilizable y puede transferirse a otras moléculas. En los procesos de biosíntesis, como en otras actividades celulares, la hidrólisis del ATP impulsa reacciones energéticamente desfavorables. Componentes de cofactores enzimáticos: Algunos cofactores de enzimas que participan en una amplia gama de reacciones químicas poseen adenosina en su molécula; tales como la coenzima A (CoA) que actúa en las reacciones de transferencia de grupos acilo, el NAD (nicotinamida adenina dinucleótido) que participa en la transferencia de hidrógenos y electrones en reacciones de oxidorreducción en las células, al igual que el FAD (flavina adenina dinucleótido), forma activa de la vitamina B2. En ninguno de ellos la adenosina participa en las reacciones, pero si se quita se reduce drásticamente la actividad del compuesto, lo cual sugiere que debe jugar un rol en la acomodación del sustrato para colocarlo en el centro activo de la enzima. El por qué es adenosina y no otro nucleósido parece tener que ver con una cuestión de economía evolutiva; una vez que se estableció que el ATP era la fuente estándar de energía química, se desarrollaron procesos para sintetizarlo más eficientes que para otros nucleótidos y como el ATP es abundante puede participar en otras moléculas. Así también existen muchas enzimas con un dominio proteico capaz de fijar adenosina.

Segundos mensajeros: La interacción de señales químicas extracelulares, primeros mensajeros (como hormonas y otras

señales) con los receptores de la superficie celular da lugar a la producción de segundos mensajeros en el interior de la célula, lo cual provoca cambios de algún tipo en el interior de la misma. Los nucleótidos a menudo actúan como segundos mensajeros. 4

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Ácidos Nucleicos

Uno de los segundos mensajeros más comunes es el nucleótido adenosina 3’,5’-monofosfato cíclico (AMP cíclico o cAMP), una forma cíclica que se forma a partir del ATP por acción de una enzima, la adenilatociclasa, asociada a la cara interna de la membrana plasmática. Otro es el GMP cíclico o cGMP. Los nucleótidos cíclicos juegan un papel importante en la mediación de los efectos hormonales y en la regulación de varios aspectos de la función celular en todas las células que no pertenecen al reino vegetal. NH 2 C

Adenina

N

C

HC

C

N C N

N 5'

O

CH 2 O 4'

H H

H

3'

O

P

1'

H 2'

O

OH

O-

Adenosina 3',5'-monofosfato (AMP cíclico o cAMP)

Las células tienen también nucleótidos con grupos fosfatos en posiciones distintas al C5’, existen ribonucleósido 2’-fosfato y ribonucleósido 3’-fosfato que son productos de la hidrólisis del ARN.

Polinucleótidos Los mononucleótidos se unen entre sí mediante uniones covalentes para formar cadenas cortas de oligonucleótidos o largas cadenas de polinucleótidos como en el ADN o en el ARN. Dos nucleótidos se unen mediante un “puente” de fosfato: el grupo fosfato del C5’ de un nucleótido se une al OH del C 3’ del siguiente nucleótido, quedando un enlace fosfodiéster. Así las moléculas de los ácidos nucleicos están formadas por esqueletos covalentes que consisten en unidades alternadas de grupos fosfato y residuos de pentosa, mientras que las bases son grupos laterales unidos a ese esqueleto a intervalos regulares. El esqueleto covalente es muy hidrofílico, los grupos OH de los azúcares son altamente polares y forman puentes de hidrógeno con el agua, al tiempo que los grupos fosfato están completamente ionizados, cargados negativamente, a pH 7. Esas cargas negativas están casi siempre neutralizadas por interacción con cargas positivas de proteínas, iones metálicos o poliaminas. Todos los enlaces fosfodiéster de una cadena tienen la misma orientación a lo largo de la secuencia; por lo que cada cadena tiene una dirección = una polaridad específica, con extremos 5’y 3’ diferenciados. En el extremo 5’ hay un fosfato libre (no hay nucleótido), mientras que en el extremo 3’ hay un OH libre (no unido a otro nucleótido). En ambos extremos puede haber otros grupos, frecuentemente uno o más fosfatos. Las secuencias de nucleótidos pueden representarse esquemáticamente así: A C G A Extremo 5’ P

P

P

P

Extremo 3’

OH

o abreviada: 5’-ACGA-3’ Por convención, una cadena o hebra simple se escribe siempre con el extremo 5’ a la izquierda y el 3’a la derecha; es decir en dirección 5’ 3’. El hecho de que cada hebra de ácido nucleico tenga polaridad es importante porque las enzimas que catalizan reacciones sobre los ácidos nucleicos reconocen esa polaridad 5’ 3’, o la opuesta 3’ 5’.

Las bases nitrogenadas de los nucleótidos influyen en la estructura de los polinucleótidos. Las pirimidinas son moléculas planas y las purinas son casi planas, con una ligera torsión. A causa de su estructura electrónica todas las bases nitrogenadas absorben la luz ultravioleta, por lo que los ácidos nucleicos se caracterizan por presentar una fuerte absorción a longitudes de onda próximas a 260 nm. 5

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Ácidos Nucleicos

Las purinas y las pirimidinas son hidrofóbicas y relativamente insolubles en agua a pH celular, cercano al neutro. Las bases, que están unidas al esqueleto de fosfatos y pentosas, se ubican de modo que los planos de los anillos de las sucesivas bases están paralelos, como monedas apiladas. Las interacciones hidrofóbicas de apilamiento de las bases, a las que contribuyen interacciones de van der Waals, ayudan a minimizar los contactos con el agua y tienen importancia en la estabilización de la estructura tridimensional de los ácidos nucleicos. El segundo tipo de interacciones entre bases se da por puentes de hidrógeno entre dos bases enfrentadas, que pueden ser de la misma o de diferente cadena polinucleotídica. Se producen entre determinados grupos funcionales: carbonilo del ciclo y amino de fuera del ciclo, o entre los N de los anillos enfrentados. Los patrones de formación de puentes de hidrógeno más importantes son los deducidos por Watson y Crick, según los cuales A se enlaza específicamente con T (o U) mediante 2 puentes de hidrógeno y G se enlaza con C por 3 puentes de hidrógeno. Este apareamiento complementario de bases será importante para la duplicación de la información genética, gracias a la síntesis de cadenas de ácido nucleico complementarias a las ya existentes.

Estructura de los ácidos nucleicos En términos de niveles jerárquicos de complejidad podemos definir: La estructura primaria de un ácido nucleico está dada por su estructura covalente, por la secuencia de mononucleótidos de la cadena. Se correlaciona directamente con la secuencia de bases nitrogenadas. La estructura secundaria está determinada por cualquier estructura regular y estable que adopten algunos o todos los nucleótidos de un ácido nucleico. Luego, en general, se considera estructura terciaria al plegamiento complejo del cromosoma bacteriano o de la cromatina eucariótica.

ADN Los organismos se diferencian entre sí porque sus respectivas moléculas de ADN poseen diferentes secuencias de nucleótidos, y por consiguiente, diferentes mensajes biológicos. En el ADN de cada célula se hallan todos sus genes, donde se encuentran especificadas las secuencias de ribonucleótidos de todas sus moléculas de ARN y por lo tanto las secuencias de aminoácidos de todas sus proteínas. Se denomina gen a un segmento de ADN que contiene la información necesaria para la síntesis de un producto biológico funcional, sea una cadena polipeptídica o un ARN. Una célula contiene muchos miles de genes por lo que las moléculas de ADN son muy largas. Puede haber una molécula de ADN como en la mayoría de los procariotas o varias como en los eucariotas. Pautas importantes para dilucidar la estructura del ADN fueron las relaciones concluidas en los trabajos de Chargaff a fines de los años 40’. Se determinó que: la composición de bases del ADN varía de una especie a otra; para una especie, los diferentes tejidos tienen la misma composición de bases; la composición de bases del ADN de una especie no varía con la edad del organismo, ni con su estado nutricional, ni con las variaciones ambientales;

en todos los ADN, la cantidad de A es la misma que la de T y la de G es igual a la de C, por lo que el número de purinas es igual al de pirimidinas, esto es, A+G = T+C. 6

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Ácidos Nucleicos

Modelo de Watson y Crick En 1953, Watson y Crick postularon un modelo tridimensional para la estructura secundaria del ADN, que estaba de acuerdo con las leyes de Chargaff y con los datos obtenidos de la difracción de rayos X. Ese modelo sigue vigente, aunque se han encontrado variaciones. Según el mismo: El ADN nativo de doble cadena está constituido por dos cadenas helicoidales de polidesoxirribonucleótidos, enrolladas alrededor del mismo eje, formando una doble hélice dextrógira. Los esqueletos covalentes hidrofílicos de pentosas y fosfatos negativamente cargados se encuentran hacia el exterior de la doble hélice, en contacto con el agua; mientras las bases nitrogenadas hidrofóbicas de ambas cadenas están apiladas en el interior de la doble hélice, con sus anillos planos muy cerca y ubicados perpendicularmente al eje longitudinal de la hélice. La distancia entre los planos de cada “peldaño” es de 0,34 nm, como se determinó por difracción de rayos X y el paso de la hélice de aproximadamente 3,6 nm se ha comprobado que corresponde a 10,5 residuos de nucleótido. La relación espacial entre las dos cadenas da lugar a la formación de un surco mayor y un surco menor en la doble hélice. Cada base de una cadena está apareada por puentes de hidrógeno con una base de la otra cadena, según lo estipulado por las reglas de Chargaff y ambas bases están situadas en el mismo plano. Se forman los apareamientos A=T y G C. Otros apareamientos diferentes desestabilizan la estructura en doble hélice. Las dos cadenas o hebras son antiparalelas, es decir su polaridad es opuesta, sus enlaces fosfodiéster 5’,3’ tienen direcciones opuestas. Las dos cadenas antiparalelas de polinucleótidos no son idénticas ni en secuencia ni en composición de bases; en cambio son complementarias entre ellas. Siempre que hay A en una cadena se encuentra T en la otra y de igual forma si hay G en una hay C en la otra. La doble hélice o dúplex de ADN se mantien...