05. Vectores basados en virus de plantas PDF

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Resumen de la materia Biotecnología vegetal dictada por Fernando Bravo...

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Vectores basados en virus de plantas Los vectores basados en virus de plantas sirven para expresar un gen de interés de manera transiente. Para ello, es necesario saber cómo se transmite el virus y cómo infecta para poder expresar un gen en una planta en particular.

Clasificación y principales características de los virus vegetales

Un virus es un conjunto de una o más moléculas de ácido nucleico, contenido en una cubierta protectora de proteínas o lipoproteínas, capaz de autoreplicarse únicamente dentro de células hospedadoras adecuadas. Esto se debe a que hay células susceptibles y permisivas a distintos tipos de virus ⇒ los virus se adaptan a un tipo celular determinado.

¿Cómo son los virus vegetales? La mayoría de los virus vegetales tienen un genoma de ARN. ★

ADN doble cadena (ADNdc): Existe sólo una familia con estas características, Caulimoviridae, que reúne a los géneros Caulimovirus (su promotor se utiliza para construcciones) y Badnavirus. Los virus de esta familia sólo infectan plantas.

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ADN simple cadena (ADNsc): Existe una sóla familia, Geminiviridae, de estas características que comprende tres géneros (Mastrevirus, Curtovirus y Begomovirus). Los virus de esta familia sólo infectan plantas.

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ARN doble cadena (ARNdc): La familia Reoviridae engloba, entre otros, tres géneros (Fijivirus, Phytoreovirus y Oryzavirus) capaces de infectar tanto plantas como invertebrados. La familia Partitiviridae, cuenta sólo con dos géneros (Alfa y Betacryptovirus) que sólo infectan plantas (existen otros géneros dentro de esta familia que infectan hongos).

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ARN simple cadena (ARNsc) de polaridad negativa: la familia Rhabdoviridae es la única asignada a un orden en particular (Mononegavirales) y agrupa dos géneros (Cytorhabdovirus y Núcleorhabdovirus) que infectan plantas e invertebrados (otros géneros de la familia infectan además vertebrados). Dentro del mismo grupo, se clasifica la familia Bunyaviridae, recientemente aceptada como tal, y en ella el género Tospovirus. Por el contrario el género Tenuivirus, que infecta sólo plantas, aún no se halla asignado a ninguna familia. Deben tener una ARN polimerasa ARN dependiente para generar ssRNA (-).

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ARN de simple cadena (ARNsc) de polaridad positiva: La mayor parte de los virus de plantas se hallan comprendidos en este grupo. Las familias Sequiviridae, Tombusviridae y Potyviridae, comprenden

géneros virales que sólo infectan plantas. Las familias Bromoviridae, Comoviridae y Closteroviridae han sido revisadas recientemente y los virus reunidos en ellas infectan sólo plantas.

Sus genomas son pequeños, tienen pocos espacios intergénicos y pueden ser mono, bi o multipartitos. Con respecto a los extremos, pueden tener extremos 5’ con cap o con proteína VPg y los extremos 3’ pueden estar polidenilados o tener una estructura tipo tRNA. Entre los genes que comúnmente están presentes en los genomas virales están las proteínas de movimiento (moléculas que cambian el tamaño de exclusión del plasmodesmo para que el virus pase de una célula infectada a una no infectada), proteínas de cápside viral, ARN polimerasa ARN dependiente (RpRd), endoproteasas, proteínas VPg, proteínas para la transmisión por vectores (ej: insectos o ratones), proteínas de unión a ácidos nucleicos y factores asociados a la transcripción.

¿Formas de transmisión de los virus? Dada su condición de parásitos intracelulares obligados, los virus necesitan transmitirse de una planta infectada a otra para iniciar un nuevo ciclo de replicación e infección: por material vivo (semillas, polen o tejidos de la planta; no son la mayoría, se propagan de generación a generación), por transmisión mecánica (las herramientas que usan los agricultores -herramientas de poda- o investigadores -agentes abrasivos- generan daños tisulares, siendo estas heridas el sitio de acceso de los virus) o por vectores (a través de distintos organismos no vegetales que actúan como intermediarios en el proceso de transmisión desde una planta infectada a otra planta huésped en la cual el virus iniciará un nuevo ciclo de replicación. Entre los vectores están bacterias, hongos, nematodos, artrópodos y arácnidos).

Sintomatología y patogénesis viral: los síntomas provocados por la infección viral ocurren, generalmente, en zonas donde el virus se replica activamente. Aquellos que se manifiestan en la zona de inoculación o entrada del virus se denominan síntomas locales, mientras que los síntomas sistémicos son los que se manifiestan en otros tejidos de la planta a medida que el virus se moviliza. Entre los síntomas está la formación de anillos (pueden ser de naturaleza clorótica o necrótica. Suelen presentarse como síntomas locales luego de la inoculación y se hallan por lo general asociados a las reacciones locales de defensa de la planta.), moteados, mosaicos (ambas denominaciones se utilizan como sinónimos para describir patrones de coloración anormales, aunque éstos pueden también ser generados por necrosis del tejido. Aunque se trata de uno de los síntomas más comunes, no todos los virus generan patrones de este tipo) clorosis (el término se utiliza para describir el resultado de la reducción de los niveles de clorofila que resultan en la decoloración -amarillamiento- de la zona afectada. A diferencia del moteado/mosaico, en este caso no existe una delimitación clara de la zona afectada), enanismo (es uno de los síntomas más comunes. Todas las partes de la planta -hojas, raíces, tallo- pueden presentar acortamiento. En particular, el acortamiento de la distancia internodal puede generar un aspecto enano en las dicotiledóneas), malformaciones (pueden ser provocadas durante el crecimiento -por ejemplo,

anormalidades en el crecimientos del tejido vascular, rugosidades, etc-, o bien sobre hojas expandidas, dando lugar a frunces, encorvamientos, distorsiones y enrollamientos), coloración anormal (en algunos casos, las nervaduras se vuelven más claras, distinguiéndose del resto de la hoja. Algunas veces, éstas no están afectadas, sino que el tejido que las rodea se ve sujeto a la clorosis, lo que da un aspecto distintivo a las nervaduras), necrosis, reducción del rendimiento, entre otros.

Vectores y amplicones virales A diferencia de la expresión de los transgenes nucleares, tanto las secuencias insertadas en un amplicón como en vectores virales logran niveles de expresión mucho más elevados. En el caso del vector viral, él mismo se replica en citoplasma y de esta manera amplifica la expresión de gen que ha sido insertado. En el caso del amplicón viral, éste es transcripto en el núcleo como un transgén normal; a su vez, este transcripto es capaz de iniciar el ciclo de replicación viral en el citoplasma, resultando en altos niveles de expresión del virus y del gen heterólogo que ha sido insertado.

Vectores: En el caso de virus a ADN, el genoma viral se clona en un plásmido bacteriano, se incorpora

un

sitio

de

clonado

múltiple

(polilinker) por ingeniería genética, que permitirá insertar en él las secuencias génicas de interés. Una vez amplificado el plásmido que contiene al vector viral recombinante en Escherichia coli, la inoculación se lleva a cabo liberando el vector viral del plásmido e inoculando las plantas en forma mecánica o a través del bombardeo con micropartículas. Dado que los virus se replican en células vegetales, cualquier secuencia incorporada en el genoma de los mismos será replicada y amplificada de manera concomitante, logrando de este modo altos niveles de expresión. En el caso de virus a ARN, una vez obtenida la versión ADNc del ARN viral se la clona río abajo de la secuencia del promotor del fago T7, el cual se encuentra en un plásmido. A continuación se incorpora por ingeniería genética un sitio de clonado múltiple (polilinker), que permitirá insertar

en él las secuencias génicas de interés. Una vez obtenido el vector viral recombinante, se lleva a cabo la transcripción in vitro (el plásmido se debe purificar y luego se agrega una polimerasa que reconozca el promotor), lo que permitirá obtener copias del vector viral en versión ARN. Las plantas son infectadas mecánicamente con estos transcriptos de ARN infectivos, los cuales iniciarán el ciclo de replicación viral en el citoplasma de la célula vegetal produciendo generalmente cantidades elevadas de la proteína cuyo gen ha sido insertado.

Amplicones: Con respecto a los virus a ARN, es posible lograr clones infectivos insertando la secuencia específica de un virus río abajo de un promotor eucariota, tal como el 35S del Cauliflower mosaic virus. Se hace una retrotranscripción para obtener un ADNc a partir del genoma viral. El ADNc se clona en un vector binario para expresarlo en plantas; además, se agrega un sitio múltiple de clonado (polilinker) para insertar la secuencia génica de interés. Una vez obtenido el amplicón viral recombinante, es posible proceder a la transformación genética estable de plantas (vía Agrobacterium tumefaciens o por bombardeo con micropartículas) o más comúnmente, evaluar la construcción por agroinfiltración. Esta técnica consiste en la inoculación con un cultivo de Agrobacterium tumefaciens portando un plásmido binario con el amplicón recombinante, de modo que se obtiene una expresión transitoria del mismo. El T-DNA va directo al núcleo.

Existen diferentes estrategias para expresar un gen foráneo en vectores y en amplicones virales: reemplazo génico (reemplazo un gen viral no esencial para la replicación y movilización por el gen de interés), inserción génica (no se deletan genes virales; el gen de interés es expresado a partir de un promotor subgenómico adicional del mismo virus o de un virus relacionado), presentación de epítopes (expresión de proteínas de fusión entre péptidos pequeños foráneos y proteína de la cápside viral; el sitio de inserción en la secuencia de la proteína de la cápside es elegido de manera tal que el epitope de interés esté posicionado hacia el exterior de la partícula viral) y complementación en trans (reemplazo de un gen esencial por el gen de interés; el vector debe inocularse en una planta transgénica que expresa el gen esencial deletado a nivel nuclear con el fin de complementar en trans al vector viral defectivo).

Ventajas y desventajas del uso de amplicones y vectores virales ➔ Los genomas virales son pequeños y por ende, son fáciles de manipular

➔ Se requiere poco tiempo para el desarrollo y análisis de las construcciones ya que puede llevarse a cabo sin necesidad de obtener plantas transgénicas ➔ La expresión del gen no es afectada por el posicionamiento genético ya que la secuencia insertada en el genoma viral puede ser altamente amplificada durante la replicación viral ➔ Se obtienen altos niveles de expresión (alrededor de 1-2% del total de proteína soluble) ➔ La infección de plantas con virus es un método simple ➔ Las secuencias insertadas son genéticamente inestables ya que son susceptibles a deleción o modificación a lo largo de la replicación viral ➔ Existen limitaciones de tamaño para la secuencia a expresar ➔ Pueden inducir síntomas en la planta huésped ➔ En en caso de los amplicones virales utilizados para obtener plantas transgénicas, su expresión puede ser disminuida o anulada por el efecto del silenciamiento génico post-transcripcional Vectores virales derivados de virus a DNA

Caulimovirus

El Cauliflower mosaic virus (CaMV) es el miembro tipo de los virus del género de los Caulimovirus. Es un virus a ADN doble cadena circular monopartito con gaps de aproximadamente 8 kpb. Los viriones son partículas isométricas, sin envoltura y de simetría icosaédrica. Se trata de un pararetrovirus que replica a través de un intermediario de ARN. A diferencia de los retrovirus, el genoma de este virus está compuesto por ADN en lugar de ARN, y se mantiene como un minicromosoma en el núcleo de la célula huésped (el ADN proviral de los retrovirus se integra en el genoma nuclear).

El genoma presenta 7 marcos abiertos de lectura (ORFs) localizados sobre la cadena de polaridad negativa y dos regiones intergénicas de 150 y 700 pb que corresponden a los promotores 19S y 35S. El resto de las regiones intergénicas tienen apenas algunos nucleótidos de longitud. Sólo 6 ORFs se traducen en proteínas. El ORFI codifica una proteína involucrada en la movilización viral (P1), el ORFII un factor de transmisión por áfidos (P2), el ORFIII una proteína de posible unión a ADN (P3), el ORFIV la proteína precursora de la cápside (P4), el ORFV una poliproteína precursora de la proteinasa, la transcriptasa reversa y la ribonucleasa H (P5) y el ORFVI una proteína transactivadora de la traducción, que además se halla involucrada en la formación de los cuerpos de inclusión o viroplasmas (P6). No se ha detectado hasta el momento ninguna proteína codificada por el ORFVII. Codifica una proteína que permite que la planta lea los distintos marcos de lectura para expresar las distintas

proteínas. El 16S produce P6 y permitirá la expresión de todas las proteínas del virus. La transmisión del virus es a través de un áfido. P2 y P3 forman un complejo que es reconocido por un receptor en el estilete del áfido

Una vez que el ADN viral alcanza el núcleo, la ARN polimerasa II dependiente de ADN del huésped transcribe la cadena codificante en un ARN mensajero de mayor tamaño que el genoma. Este ARNm, al que se denomina 35S (transcripto a partir de tal promotor), sirve no sólo como molde para la traducción de varias proteínas sino también como templado para la transcripción reversa, que dará origen a las múltiples copias genómicas que luego serán empaquetadas. Por el contrario, el ARNm denominado 19S (y transcripto a partir del promotor del mismo nombre), es monocistrónico. La proteína codificada por el ORFVI se traduce a partir de éste y está encargada de transactivar la traducción del ARNm 35S. Ambos ARN mensajeros presentan una estructura cap en su extremos 5’ y se hallan poliadenilados en sus extremos 3´. El promotor 35S es fuerte y constitutivo, y da lugar a la expresión de genes en todos los tipos celulares cualquiera sea el estadio de desarrollo de la planta. Se han identificado además varias versiones del ARNm 35S que han sido procesadas por splicing alternativo. Este proceso es esencial para proveer de los ARNm apropiados para expresar el conjunto completo de las proteínas virales. El promotor 19S es mucho débil que el de 35S.

Ejemplo de vector viral basado en el virus del mosaico del coliflor (CMV): Se diseñó un vector de reemplazo en el que se sustituyó la secuencia del ORFII (el ORFII, el ORFVII y una pequeña porción interna del promotor 35S se consideran no esenciales para el proceso de infección viral) por el gen que codifica la enzima dihidrofolato reductasa (dhfr) de E. coli.

Las primeras dos construcciones fueron utilizadas como controles y las dos últimas poseen el transgén en distintos contextos respecto del ORFII. La expresión del gen fue analizada por Western Blot (anticuerpos específicos para la proteína) y se observó que la construcción Ca-NB2 fue la que permitió mayores niveles de expresión.

Vectores y amplicones virales derivados de virus a RNA

Potexvirus

El Potato virus C (PVX) es el miembro tipo de los Potexvirus. Es un virus envuelto cuyo genoma es una molécula única de ssRNA (+) de 6,4 kpb. El virus infecta principalmente plantas de la familia de las solanáceas, produciendo mosaicos, moteados y necrosis; su transmisión ocurre naturalmente por contacto, no se han descripto insectos vectores. El genoma posee cinco marcos de lectura (ORF 1, 2, 3, 4 y 5). El ORF 1 es una ARN polimerasa ARN dependiente (RpRd) que genera muchas copias de mRNA de polaridad positiva (genoma = mRNA) y los ORF 2, 3 y 4, denominados el “bloque triple” son genes parcialmente superpuestos que poseen su propio promotor subgenómico (PSg) y son traducidos a partir de un marco de lectura diferente; codifican proteínas involucradas en el transporte intercelular del virus. El ORF 5 codifica la proteína de la cápside viral. Los ORF 2→5 poseen entonces promotores subgenómicos sobre el molde de polaridad negativa que permitirán su expresión. Los mRNA poseen un extremo 5’ cap.

Ejemplo de vector viral basado en el virus x de la papa: el transgén debe estar bajo la dirección de un PSg. Los vectores virales pueden ser de reemplazo (el gen de la cápside se reemplaza por el gen de interés → impide movilización y consecuente infección viral de nuevas células) o de inserción (el gen de interés se inserta bajo algún promotor subgenómico y no reemplaza a ningún gen viral). Si se hace inserción hay que cuidar que el PSg no sea el mismo que el PSg original para evitar recombinación homóloga; en cambio, se puede usar un PSg de otro virus potex. Una vez construído un plásmido, se linealiza por un sitio río abajo el poliA y se hace una transcripción in vitro.

Con los vectores virales no hacemos una expresión estable sino una expresión transiente. Generará una infección sistémica y la planta generará el producto del transgén, una proteína recombinante. Los niveles de expresión del transgén no será la misma expresión que la expresión de las proteínas virales

La expresión basada en vectores virales no sólo permite la producción de proteínas de interés en tejidos diferenciados sino también la acumulación de las proteínas en distintos espacios celulares. Si el transgén se fusiona a un péptido señal (ejemplo, péptido señal de retención de retículo endoplásmico -péptido KDEL-) puede ser expresado en los distintos compartimentos intracelulares.

Ejemplo de vector viral basado en el virus x de la papa: Muchas aplicaciones biotecnológicas requieren altos niveles de expresión de las proteínas recombinantes. Una estrategia para alcanzar este objetivo es integrar el vector viral que incluya al transgén de interés (amplicon viral) en plantas transgénicas. La estrategia se basa en que la transcripción del amplicón producirá un transcripto infectivo del virus, el cual iniciará el ciclo de infección viral generando altos niveles del producto deseado. Sin embargo, la replicación viral es afectada por el mecanismo de silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) por lo tanto para alcanzar los niveles de expresión esperados, se requiere reprimir este mecanismo. La imagen muestra representaciones esquemáticas de amplicones basados en el genoma del Potato virus X que incluyen al gen uidA de la b-glucuronidasa (GUS), que fueron expresados en plantas transgénicas de Nicotiana tabacum. Las plantas utilizadas para expresar estos amplicones expresaban también un potente supresor viral del PTGS, la proteína P1/HC-pro del Tobacco etch virus (TEV).

Los amplicones virales pueden también utilizarse como herramientas para silenciar específicamente genes endógenos o transgenes integrados en forma estable. Como la planta ya expresa una proteína, se puede inducir el silenciamiento del gen endógeno por expresión del mismo en un vector viral.

Comovirus

El virus del mosaico del frijol (CPMV) es el miembro modelo del género Comovirus que infecta principalmente legumbres y se transmite a través de las abejas. Posee un genoma bipartito de ssRNA (+) y estas dos moléculas de ARN se encapsidan en partículas virales independientes.

Ambos ARNs poseen una proteína Vpg en el 5’en vez del cap y poseen una cola poliA. Contienen un único marco abierto de lectura y dirigen la síntesis de dos poliproteínas que son clivadas por una proteasa viral. Las proteínas codificadas por la molécula de ARN-1 son necesarias y suficientes para la replicación del virus, mientras que el ARN-2 codifica las proteínas de la cápside y aquellas involucradas en la movilización viral. Se han atribuído diferentes funciones a las proteínas codificadas en el ARN-1. Esta molécula es más larga que la molécula de ARN-2 y codifica para una proteasa que procesa las proteínas producidas a partir de ARN-1 y ARN- que primero actúa en...