1. Secuenciacion Ion-Torrent PDF

Preview

Summary

Resumen de la tecnica Ion torrent...

Description

SECUENCIACION ION-TORRENT La secuenciación IonTorrent consiste en una NGS (Next Generation Sequencing o secuenciación de 2º generación) que se fundamenta en el cambio de pH (por la liberación de protones

+¿ ¿ H

durante el enlace fosfodiéster) para identificar los nucleótidos que se van añadiendo a la cadena de ADN. Capaz de secuenciar cadenas de hasta 400pb a un precio bastante decente. Tiene margen de mejora por el aumento de la densidad de chips (ley de Moore).

Para ello, se necesitan beads (perlas), cada uno de las cuales tendrán unida a su superficie secuencias de DNA (la misma secuencia siempre). Estas se dispondrán en micro-pocillos, una bead por cada pocillo, en donde habrá un sensor de detección de pH (ISFET), gracias al cual se podrá detectar si el nucletido se ha unido o no, ya que es capaz de detectar con precisión los cambios de voltaje. Para identificar qué nucleótido se ha unido lo que se hace es inundar la placa de micropocillos (con los beads dentro) con dNTPs del mismo tipo (A, T, G o C), por tanto habrá que hacer ciclos de 4 inundaciones cada vez. Es importante destacar que los nucleótidos que se utilizan son los naturales, no tienen ninguna modificación (como en otras técnicas de secuenciación). No confundir con la pirosecuenciación de roche 454, la cual se basa en la actividad lumínica liberada por la muestra durante el proceso, es decir, es una detección óptica. La secuenciación IonTorrent , en cambio, utiliza una detección química. IonTorrent

Pirosecuenciación

Protocolo

b) Creación de la librería de ADN gracias a la acción de enzimas para obtener los fragmentos de interés. Añadir adaptadores generales (complementarios a las secuencias de los beads) a los fragmentos de ADN para que puedan hibridarse con las secuencias de las perlas y amplificarse. c) PCR de Emulsión: para la amplificación se usan perlas de hibridación para que a cada perla se le una un único fragmento de ADN, para conseguir esto se usa una emulsión de lípidos que crean liposomas los cuales en su interior tengan la perla de hibridación y un fragmento de ADN. Cada liposoma actúa como un “reactor” de PCR. d) Carga del chip: se introduce un bead en cada pozo Resultados

b -> En esta gráfica se representa los cambios de voltaje en un micropocillo. Cada pico indica que se ha detectado la unión de un nucleótido. c -> Se muestran las cantidades de nucleótidos que se han unido por cada flow (“inundación”). Una gran desventaja de la IonTorrent es que cuando aparece la misma base repetidas veces, no se puede detectar el número exacto de esta. Es decir, si aparecen seguidas 7 Timinas no podemos saber con exactitud si son 7 u 8. Nos ofrece información poco precisa....