15) Clostridium-e-test-di-fluttuazione N 15 PDF

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Clostridium botulinum Genere: Clostridium Specie: Botulinum (Botulus:salsiccia) Gram+ Sporigeno (endospora centrale o terminale che a differenza di Tetani non deforma lo sporangio) Forma di bacillo Anaerobio obbligato Mobile (soprattutto flagelli peritrichi) Ne esistono diversi tipi classificati in base alla localizzazione geografica (in antichità) e non tutti sono associati a patologie (lo sono nell’uomo il tipo A e il tipo B, il piu diffuso in Europa). Le spore sono diffuse nell’ambiente ma si ritrovano soprattutto come contaminanti alimentari, a livello intestinale di molti animali e essendo anaerobi, la spora tende a germinare in quei preparati alimentari privi di aria e non sterilizzati adeguatamente; la spora nel tempo anche a T ambiente tende a germinare e produrre la cellula vegetativa che può poi produrre la neurotossina botulinica e quindi anche se ingeriamo un batterio morto resta comunque la tossina (a meno che non raggiungiamo T di almeno 100°C per almeno 3-5 ore) e si manifesta la patologia e quindi la paralisi flaccida. La cellula vegetativa all’interno di un alimento fermenta alcuni composti e quindi può produrre gas (le confezioni non fanno piu il “gioco” del tappo o si deformano quando la carica microbica è molto elevata o si produce una minima quantità di tossina che è molto potente). Se l’alimento è ingerito da un individuo adulto con microbiota intestinale maturo (quindi siti di adesione occupati e presenza di microbi che funzionano da antagonisti) o la spora non germina perché non aderisce oppure se aderisce e germina, la competizione microbica (“antagonismo batterico" ad opera soprattutto dei lattobacilli) non la fa duplicare a sufficienza e non si ha produzione della tossina in tarda fase esponenziale. Quindi l’ingestione di prodotti contaminati da spore nell’individuo adulto non da problemi ma fino all’età di 2 anni il microbiota non si può considerare maturo e soprattutto dipende dall’alimentazione che nei neonati è, come sappiamo, a base di latte, e quindi la spora duplica facilmente e produce la tossina; negli USA e anche in altri paesi europei infatti è stato proibito l’uso del miele (alimento principalmente contaminato da spore) e dei suoi derivati, per la produzione di alimenti per la prima infanzia. Riduzione del “fenomeno della morte in culla”: bambini entro i 2 anni morti per asfissia in culla dovuta a paralisi spastica (i muscoli intercostali non si contraevano). Le tossine botuliniche (vedi meccanismo sbobbine precedenti) sono le più potenti che si conoscano: ossia 1 mg ucciderebbe 6 miliardi di topi; la dose letale per l’uomo è

1μg/Kg di peso corporeo; relativamente tremolabile a 100°C/10’ e resistente ai succhi gastrici. Abbiamo vari tipi di botulismo: -Botulismo alimentare (intossicazione), con debolezza ed uno stato confusionale dopo 1-2 giorni dall’ingestione dell’alimento, vista offuscata, bocca secca, pupille dilatate, costipazione, dolori addominali, assenza di febbre, paralisi flaccida (la mortalità può essere elevata). -Botulismo infantile, dovuto a alimenti contaminati da spore e prevede la colonizzazione del tratto gastrointestinale del bambino (1-6 mesi) -Botulismo da ferita, molto raro perché la ferita deve essere contaminata da un numero elevato di spore e la carica sporale richiesta per germinare è maggiore.

Confronto tossina botulinica e tetanica: -Simili per struttura e funzione (sono entrambe tossine del tipo A-B) -Hanno un target comune come la sinaptobrevina (VAMP) coinvolta nell’impacchettamento vescicolare -Entrambe provocano idrolisi delle proteine target, blocco del rilascio del neurotrasmettitore e paralisi -La tossina botulinica rimane nelle terminazioni nervose, mentre la tetano tossina è trasportata dal trasporto assonico retrogrado nella corda spinale. -La tossina tetanica agisce inibendo la trasmissione inibitoria cioè bloccando il rilascio di GLICINA o GABA, mentre la tossina botulinica agisce prevenendo il rilascio di ACETILCOLINA -In entrambi i casi il recupero delle funzioni richiede la rigenerazione delle terminazioni nervose -La terapia per entrambi comporta la somministrazione di metronidazolo (antibiotico) e vaccinazione (nel caso del botulino si somministra l’antitossina botulinica trivalente A, B e E).

Clostridium perfingens Associato a una patologia comune nei tempi di guerra (ferite contaminate) ma oggi giorno la si riscontra come un infezione in seguito a fratture osse esposte e all’ingessatura sbagliata (crea dei microambienti di anaerobiosi che favoriscono la germinazione delle spore e la produzione di tossine). Abbiamo 5 tipi (classificati da A a E) e quello responsabile delle infezioni nell’uomo e quindi della patologia piu comune che è la gangrena gassosa, è il tipo A che produce 6 tossine minori (responsabili della degenerazione dei tessuti e quindi alla penetrazione e alla diffusione del batterio), un enterotossina e una neuroaminidasi (enzima che favorisce l’adesione stabilizzando il batterio al recettore).

Es. tossina alfa: è una fosfolipasi C che provoca lesioni a livello della membrana citoplasmatica e porta a morte cellulare o perdita di liquidi. A seconda della carica microbica si possono avere diversi tipi di patologie e quella meno dannosa è la cellulite (formazione di gas a livello tissutale e in seguito a formazione di tossine, il tessuto può diventare necrotico e degenerare; la fascite o miosite suppurativa invece comporta una penetrazione del derma con un accumulo di pus nei fasci muscolari, ma assenza di necrosi muscolare; fino ad arrivare alla diffusione della tossina e del batterio in circolo e un interessamento generale degli arti con gangrena gassosa o mionecrosi (tipico odore putrido, di carne marcia). Per non arrivare alla gangrena gassosa ci si sottopone alla camera iperbarica per evitare l’amputazione dell’arto. Nella gangrena gassosa le spore penetrano attraverso una grave ferita traumatica; la mancanza di O2 determina abbassamento del potenziale di ossidoriduzione e crescita dei clostridi anaerobi che producono tossine alfa (riduce la contrattilità del miocardio) e iota (riduce la resistenza vascolare sistemica danneggiando la parete dei vasi):ciò porta al collasso emodinamico. Dopo circa una settimana: necrosi muscolare, danno renale, shock e morte. Le tossine provocano estesa emolisi e sanguinamento. Come alimentare invece il decorso clinico può essere autorisolvente, cioè se la patologia è dovuta alla enterotossina questa porta a perdita di liquidi ed elettroliti, distrugge i tessuti epiteliali intestinali e se non si ha la penetrazione della mucosa è appunto autorisolvente; la penetrazione si ha in caso di carica microbica elevata o equilibrio alterato in seguito a cura antibiotica molto forte (il microbiota perde efficienza e si avvantaggia la duplicazione dell’enterotossina). L’enterotossina di perfringens viene prodotta gia all’interno dello sporangio e quindi quando si ha la germinazione si ha rilascio sia della cellula vegetativa che dell’enterotossina. Il meno virulento è il clostridium difficile che è un nostro commensale del microbiota intestinale che però può diventare patogeno e dare da una lieve diarrea a una colite pseudomembranosa (estesa ulcerazione della mucosa del colon). I fattori di virulenza sono le diverse tossine, i fattori di adesione, ialuronidasi, citotossine, enterotossine e formazione di spore.

Questo test è stato fatto nei primi anni 40 da due ricercatori, Luria e Delbruck, perché si era già a conoscenza delle mutazione ma il dubbio era se queste avvenivano a causa dell’ambiente che mi modifica il DNA e poi seleziona in maniera positiva o negativa, oppure se la mutazione avviene casualmente e l’ambiente semplicemente le seleziona. Furono usate cellule batteriche (perché hanno tempo di duplicazione minore e non hanno un grosso DNA tale da poterlo sequenziale, e tante altre proprietà ottimali di studio) in particolare E.Coli ed è stato preso un ceppo con una sensibilità a un determinato ambiente che può essere una sostanza chimica, un farmaco, un virus e loro scelsero un ceppo sensibile al batteriofago T1 (virus che infetta il batterio). Durante la duplicazione sicuramente si sarebbero viste delle mutazioni che faranno in modo che alcune di queste cellule pur derivando dallo stesso ceppo, diventino resistenti al batteriofago; quando alla fine andavano a piastrare trovavano cellule sensibili e cellule mutate resistenti al batteriofago. Queste mutazioni quando e perché sono insorte? Test: Si parte da una popolazione geneticamente uniforme (CFU) e queste cellule hanno la caratteristica particolare di essere sensibili al batteriofago T1; le cellule sono state poi stemperate, messe a crescere in un terreno ricco e a una T ideale per E.Coli in un’unica beuta (ipotizziamo 1L) in modo da avere una popolazione uniforme di batteri.

Si divide poi in due aliquote (500mL ciascuna) il contenuto della beuta e da queste poi successivamente si è ottenuta un’unica beuta grande da 500mL e 50 beute piccole da 10mL ( in questo caso 50 perché consideriamo come volume iniziale 1L e come volume dimezzato tra la beuta grande e le piccole 500mL). Le beute ( quella grande e le 50 piccole) sono tra di loro uguali per quantità di coltura per poter essere paragonabili; l’unica differenza è che tra le beute piccole c’è una divisione spaziale (cioè è stato suddiviso il volume iniziale di 500 mL in queste 50 beute ognuna da 10 mL), nel caso della beuta grande invece abbiamo un unico ambiente, quindi nessuna divisione spaziale tra le cellule. Si lascia crescere (per lo stesso tempo, nello stesso ambiente e con gli stessi nutrienti) e in tarda fase esponenziale sono state piastrate su un ugual numero di piastre (terreno solido) contente il batteriofago (funge da ambiente). L’ambiente (il batteriofago) induce la mutazione o la seleziona soltanto? Se avessi piastrato direttamente le cellule sensibili, quindi la CFU di partenza, io non avrei avuto colonie perché il batteriofago avrebbe lisato tutte le cellule. Invece io ho dato tempo per crescere e se la mutazione è indotta dal batteriofago (questo mi induce mutazione sul DNA in modo tale da avere resistenza), dovrei ottenere sulle piastre piu o meno tutte colonie resistenti in entrambi i casi (beuta grande e beute piccole). In realtà sulle piastre ottenute dal contenuto delle beute piccole il numero di colonie varia a seconda della piastra (da 0 a 100, quindi fluttuazione), invece sulle piastre ottenute dal contenuto della beuta grande non ho un numero fluttuante ma costante (da 3 a 7, per errori di pipettamento). Hanno cosi dedotto che la mutazione non è indotta dall’ambiente ma l’ambiente seleziona positivamente (ha lisato tutte le cellule sensibili), e in piu da questi numeri hanno anche dedotto che la mutazione è rara, avviene casualmente ed è ereditabile. Rara perché nelle piastre ottenute dalla beuta grande ho un numero basso di colonie che hanno sviluppato la resistenza. La mutazione è avvenuta durante la crescita microbica una sola volta, cioè a livello di una cellula e le altre l’hanno ereditata ed è avvenuta in maniera casuale durante la duplicazione, e a seconda del momento della curva di crescita in cui avviene la mutazione, io posso avere piu o meno cellule che hanno ereditato la mutazione. Cioè se la mutazione avviene alla fine della duplicazione, quindi per ultima, e io piastro un’aliquota proveniente da questa provetta, io avrò una sola di colonie mutate; se invece la mutazione avviene prima, tutte quelle colonie derivanti da questa avranno una mutazione. Quando invece piastro la beuta grande, non essendoci divisione spaziale, sicuramente la distribuzione delle cellule mutate è piu omogenea all’interno dell’unica beuta e quindi avrò un numero piu o meno costante di colonie mutate e colonie non mutate (non riesco ad evidenziare bene). Quindi l’ambiente seleziona una mutazione che è avvenuta casualmente e raramente durante la curva di crescita, ed è ereditabile per la fluttuazione evidenziata.

Questa cosa è vera sempre? No, perché esistono delle sostanze chimiche o fisiche (agenti mutageni) che vanno ad agire sul DNA e lo mutano con una frequenza piu alta e in alcuni casi non sono neanche ereditabili....