16. Transporte activo secundario PDF

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Biofísica - Membranas y transporte...

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Biofísica

Tema 16. Transporte activo secundario: La diferencia entre el transporte activo primario y secundario reside en que en el transporte primario es el propio transportador el que consume la energía para realizar el transporte, mientras que en el transporte activo secundario la energía la consume un segundo transportador para generar un gradiente que será empleado por el primer transportador para realizar su función. Los transportadores que realizan transporte activo secundario son cotransportadores, tanto antiportes como simportes.

Cotransporte por gradiente: En la tabla se muestran los distintos tipos de cotransportes dirigidos por Na+ o H+. Transportador Na+/glucosa: Uno de los transportadores importantes es el de Glucosa/Na+ con actividad simporte. Este transportador se encuentra en la zona apical de las células epiteliales del intestino, estando en contacto directo con el lumen intestinal. Como las células se encuentran polarizadas, la asimetría se transmite también a la morfología y a la distribución de sus transportadores. Siempre hay más sodio fuera de la célula que dentro, y en el intestino, además, hay sodio de la dieta. Por tanto, lo que hace este transportador es introducir de forma simultánea a la célula una molécula de glucosa por cada dos moléculas de sodio, de esta manera se consigue captar la glucosa que se encuentra en el intestino e introducirla en contra de gradiente por el transporte activo secundario. Una vez dentro de la célula, la glucosa pasa a la sangre a través de los transportadores GLUT2, localizados en la cara basolateral, para su distribución al resto de los tejidos. GLUT2 transporta a favor de gradiente por difusión facilitada. También tenemos que tener en cuenta al Na+, que por acción del transportados Glucosa/Na+, se va acumulando en la célula. Para que no se dé un desbalance de las cargas y, por tanto, un cambio en el potencial de membrana, una ATPasa en la zona basolateral, la bomba de Na+/K+, exporta 3Na+ a la sangre a la vez que importa 2K+ al interior celular. En vertebrados se usa un gradiente de Na+, a falta de sodio se utilizan protones. Sin embargo, los invertebrados solo utilizan un gradiente de H+. Familias de transportadores secundarios: o

MFS (major facilitator superfamily): más importante, mayor número de miembros.

o

LeuT Superfamily.

o

MCF (mitocondrial carrier family).

Los transportes primarios importantes son o de protones o de sodio, y gracias a estos gradientes se generan el resto de transportes activos, siendo secundarios a estos.

Cotransporte electroneutro de aniones: Intercambiador de Cl-/HCO3-:

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Biofísica El CO2 no viaja en estado gaseoso por la sangre (donde hay una mínima cantidad de gases disueltos), sino que viaja disuelto en forma de bicarbonato en el interior de los eritrocitos. Este intercambiador, por tanto, permite el transporte de CO2 desde otros tejidos a los pulmones. En los tejidos, cuando el eritrocito llega al tejido que produce CO2, lo capta y la anhidrasa carbónica lo convierte en bicarbonato, que se libera intercambiado por cloruro y se disuelve en el plasma sanguíneo. En los pulmones, el bicarbonato entra desde el plasma sanguíneo, se da el proceso contrario por la anhidrasa carbónica que lo convierte a CO2; es decir, el bicarbonato se vuelve a intercambiar con cloro, disocia a CO2 y H2O, y, finalmente, este CO2 es exhalado. Por tanto, hay movimiento simultáneo de iones: un ion bicarbonato y un cloruro en direcciones opuestas generan un intercambio electroneutro; es decir, sin cambio en el potencial de membrana. Son, además, secundarios, porque están basados en gradientes preexistentes, como el gradiente de CO2.

Efecto del pH intracelular en la actividad de los transportadores de H+: El pH intracelular regula las actividades de los transportadores de H+. El pH citosólico de la mayoría de células es ≈7.2 y posee un rango pequeño (entre 6,8 y 7,6) donde la actividad de los transportadores no se ve afectada. Aumentos por encima de este valor, activan el antitransportador Cl-/HCO3-, que exporta HCO3- a cambio de Cl-. La función de esta enzima es disminuir el pH citosólico hasta el valor óptimo. Por el contrario, una pequeña reducción del pH activa el transporte Na+ HCO3-/Cl-, que importa Na+ y HCO3- (a favor de gradiente) a cambio de Cl- (en contra de gradiente). El HCO3- importado se combina con los H+ del metabolismo y genera CO2, que difunde fuera de la célula. La consecuencia es un aumento en el pH citosólico. A valores aún más bajos de pH, se activa el antiporte Na+/H+ (bomba), provocando un incremento más rápido del pH citosólico.

Cotransportadores MFS: MFS es la familia más grande de transportadores con 70 representantes en E.coli y más de 3.000 en el resto de microorganismos. Es una familia muy heterogénea, aunque todos ellos tienen cosas en común: o o o

Tienen entre 400-400 aminoácidos en una única cadena polipeptídica de 12 hélices TM organizadas en 2 dominios. Tienen una débil homología de secuencia (LacY con otros varía un 35-75%), aunque hay una secuencia conservada que es RxxRR en los lazos conectores L2-2 y L8-9. Tienen una alta conservación en los centros de unión a azúcares. 167

Biofísica Los cotransportes más representativos son el simporte LacY (lactosa permeasa) y el antiporte GlpT de E.coli. Lactosa Permeasa (LacY): La lactosa permeasa (LacY) presenta un simporte de H+ y lactosa. Su transporte es muy específico de la galactosa que compone la lactosa (lactosa = glucosa + galactosa), por lo que no transporta ni glucosa ni D-glucopiranósidos. Se ha visto que puede translocar lactosa a favor del gradiente sin translocar H+, pero no pueden transportar H+ en ausencia de azúcares, por lo que se sugiere que la unión a azúcares es el paso inicial del simporte. Este transportador se contiene en su mayoría embebido en la bicapa lipídica, quedando pocos elementos expuestos en el citosol. Incorporación de lactosa en E.coli: El metabolismo de E.coli proporciona la energía necesaria para el transporte primario de H+ fuera de la célula a través de una bomba. Gracias a este transporte se establece un gradiente de protones y también de cargas a través de su membrana, generando un gradiente electroquímico. Este gradiente electroquímico es utilizado por el transporte activo secundario de lactosa, que introduce lactosa en contra de gradiente a la vez que incorpora protones, es decir, es un simporte. Por tanto, este transporte secundario depende de la entrada de protones inducida por la bomba de H+. Una de las formas por las que se descubrió que el transporte dependía del gradiente de protones fue por la inhibición del gradiente con cianuro, ya que se vio que durante la inhibición no se daba transporte de lactosa al interior. Podemos ver cómo en un medio con una determinada concentración de lactosa ésta se va introduciendo dentro de la célula, aumentando su concentración intracelular. Justo cuando añadimos CN- baja la concentración de glucosa rápidamente, hasta el nivel basal (el del medio). Lo mismo pasa si cultivamos desde un principio con CN-, que la concentración intracelular nunca superará a la extracelular, sino que se igualarán. En esta gráfica lo comparamos con el transporte secundario de glucosa, en el que la fuente de energía es descargar el gradiente de sodio. Es por eso que solo vemos la entrada de glucosa al añadir sodio, ya que el transporte de glucosa es por simporte con el sodio. Si no ponemos sodios fuera, la única manera por la que la glucosa entrará en la célula es por difusión facilitada, por lo que la entrada será mucho más lenta y nunca podrá superar la concentración del medio. Algo parecido ocurría con la lactosa y los H+. Modelo de la lactosa permeasa de E.coli: Se consiguió cristalizar por primera vez la conformación del transportador LacY en su conformación hacia el interior, es decir, con una cavidad hidrofílica expuesta a la cara citosólica. El centro que une está equidistante de ambos lado. Para poder cristalizar la proteína se necesita favorecer una de las estructuras de la proteína y que ésta además se mantenga en la membrana. Por eso, en este caso, emplearon un inhibidor 168

Biofísica del transportador, el TDG (1-tio-β-D-galactopiranósido) que se muestra en la imagen como bolitas negras en el centro de unión al sustrato. La unión del sustrato rompe un puente salino entre la Arg144 y Glu126 y el H+ de la His322 se transfiere a la Glu325. Entonces, la Glu269 se recluta para formar un puente salino con la Arg144, lo que desencadena el cambio conformacional. Mutaciones en alguno de los aminoácidos mencionados hace que no se transporte lactosa. En la translocación de los protones se encuentran involucrados la His322, arg144, Glu325 y Glu269. Pasos de la translocación acoplada: Al principio la LAcY se encuentra abierta al periplasma, permitiendo la unión de H+ a la His322, es decir, puede protonarse espontáneamente (a-b). Una vez protonada, se le une el sustrato S, lo que provoca la ruptura del puente salino (marra negra) Arg144-Glu126 (c). En este momento, el H+ que se había unido a la His322 se transfiere a Glu325, y a su vez, Glu269 forma un puente salino con la Arg144 y un pdH (marra discontinua) con Trp151. Esto desencadena un cambio conformacional, quedando LaY abierta al citoplasma (d). Entonces, el sustrato es liberado al citoplasma rompiéndose el puente salino que había creado (e). Seguido, Glu325 se desprotona volviendo a recuperar el puente salino que lo unía con Arg302 (f). La restauración del puente salino provoca un cambio conformacional en LacY, haciendo que se rompa el pdH y que vuelva a quedarse abierta al periplasma (a). Este modelo se denomina de acceso alternado y es aplicable tanto para LacY como para GlpT. Transportador de glicerol-3-fosfato (GlpT): El transportador de glicerol-3-fosfato (GlpT), presenta un antiporte que importa glicerol-3-P (G3P) y exporta fosfato inorgánico (Pi) a concentraciones de mM dentro de la bacteria. Es específico del fosfato del G3P porque a la célula no le interesa introducir glicerol de forma libre. Esto se debe a que el glicerol tiene un coeficiente relativamente alto de difusión a través de la membrana, por lo que podría salir por difusión simple. Además, el G3P introducido puede usarlo directamente como precursor para la síntesis de lípidos. Topología de GlpT: El GlpT está formado por 452aa distribuidos casi en su totalidad a lo largo de la membrana. Los dominios C y N-terminales presentan poca homología, y las Arg45 y 269 son esenciales para su función.

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Biofísica Estructura de GlpT: El transportador compuesto de 12 hélices TM presenta una simetría. Las 4 hélices que se alinean para dar lugar al poro central son las hélices amarillas (H2, H5, H8, H11). Las 4 hélices verdes (H3, H6, H9, H12) no forman en poro. Las hélices azules contienen argininas, que al ser positivas constituyen la región de unión al Pi. La superficie del poro de translocación es neutra exceptuando 2 residuos: Arg45 en la H1 y Arg269 en la H7, que atraen al G3P. Modelos de cambios conformacionales en el ciclo de transporte: El enzima alterna entre la conformación abierta al periplasma (Co) y la abierta al citoplasma (Ci). El sustrato (G3P) como se mueve del exterior al interior, por lo que se une a la conformación Co provocándole el cambio de conformación a Ci que la libera al interior celular. El sitio de unión único alternaría el acceso a uno u otro sustrato (G3P, Pi) mediante este mecanismo basculante. En verde se muestra el dominio N y en azul el dominio C. En general éste es el mecanismo propuesto, sin entrar en la forma global de la proteína, basado en las estructuras de los transportadores abiertos hacia el citoplasma (de lactosa y G3P) y abiertos hacia el periplasma (del transportador de glucosa). Antiporte de Na+/H+ (NhaA): El antiportes de Na+/H+ es más difícil de estudiar porque por difracción de rayos X podemos ver los sodios pero no podemos ver dónde se encuentran los protones. Este transportador como intercambia iones sodio por protones, su actividad y cambios conformacionales están regulados por el pH del medio. Estructura básica de la translocación del Na+/H+: En la imagen se muestran las TMs orientadas de forma paralela a la membrana con la cara citoplasmática arriba. Los residuos cuyas alteraciones afectan la regulación por pH, Km aparente o ambas, se muestran con la cadena lateral y de color azul, negro y morado respectivamente. La posición aproximada del lado citoplasmático se indica con líneas discontinuas rojas. En la figura b se muestran las interacciones entre las hélices importantes para la regulación por pH y los enlaces de Van der Waals que establecen se indican en líneas discontinuas rojas). Mecanismo propuesto de la regulación del pH y la translocación del NhaA: En primer lugar, hay que comentar que en todas las conformaciones las TMSs IV/XI se encuentran unidas mediante la atracción de cargas que se da entre los residuos Asp133 y Lys300. Cuando el pH del medio es alcalino el NhaA se encuentra en conformación cerrada. En esta situación el transporte de iones es impedido por la barrera periplásmica de iones (franja transparentosa de color naranjada) y por el único sitio de unión a Na+(Li+) parcialmente expuesto.

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Biofísica La activación es inducida por el pH alcalino, el cual induce cambios conformacionales en la hélice XI resultando en la reorientación de las hélices IVc y XIp (interacciones indicadas por puntitos azules). Ahora el sitio de unión a sodio/litio (círculo transparente amarillo) está expuesto al citoplasma (puntitos rojos) y cerrado a la cara periplásmica (barra naranja). Al alcalinizarse más el medio el sitio de unión a sodio/litio se abre a la cara periplásmica exponiendo el centro activo también a él, liberándose así el catión (Na+) . La salida del sodio hace que entren dos protones al sitio de unión, dándose la protonación de los aspartatos (164 y 163) que le permite al antiporte volver a la conformación activa (abierta al citoplasma). La apertura del poro para la entrada del sustrato y salida de los protones se permite gracias a que algunas α-hélices no son completas si no que están compuestas por dos semi-hélices unidas por un elemento móvil. Como resultado por cada ciclo funcional se exporta 1Na+ por 2H+ importados

Cotransportadores MCF: Los cotransportadores MCF (Mitorcondrial Carrier Family) poseen una secuencia característica PxD/ExxK/RxK/R(20-30res)_D/EGxxxxaK/RG donde x significa cualquier residuo y a un aa aromático. En el lado de la matriz hay un bucle que "cierra" la cesta. AAC (ADP/ATP carriers): Son transportadores localizados en la membrana interna mitocondrias que se encargan de transportar ADP y Pi al interior de la matriz permitiendo que salga el ATP recién sintetizado al citosol. Entre ellas encontramos la adenina nucleótido translocasa (antiporte) que asociada a la fosfato translocasa (simporte) y la ATP sintasa (transporte primario) forman un único complejo ligado a la membrana, conocido como ATPsintasoma. La adenina nucleótido translocasa es un sistema de cotransporte antiparalelo (antiporte): importa el ADP a la matriz y exporta el ATP. El efecto de reemplazar ATP 4- por ADP3- es la salida neta de una carga negativa, lo que está favorecido por la diferencia neta de carga a través de la membrana interna (exterior positivo). Este transportador, por tanto, desde el punto de vista termodinámico, está funcionando como un trasportador de difusión facilitada. A pH7, el Pi se halla presente tanto en forma de HPO42- como de H2PO4-, pero la fosfato translocasa es específica para el segundo. No hay flujo neto de carga durante el cotransporte paralelo de H2PO4- y H+ realizado por este simporte (entran una carga negativa y una positiva que se anulan).

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Biofísica A parte de los protones importados por la fosfato translocasa, la concentración de protones relativamente baja en la matriz favorece el movimiento de H+ hacia el interior mediante la ATP sintasa, acumulándose. La fuerza protón-motriz generada es responsable tanto de proporcionar la energía para la síntesis de ATP como del transporte de sustratos (ADP y Pi, el Pi se introduce por la ATP) al interior y del producto (ATP) fuera de la matriz mitocondrial. Inhibidores de la ACC mitocondrial: Para facilitar la cristalización de una u otra forma de esta proteína hemos introducido inhibidores que la bloquean por un lado o por otro. La CATR se une al espacio intermembrana y el BA por el lado de la matriz. Topología y estructura: En este caso se ha localizado que hay una cardiolipina que interviene en el trasporte y que es esencial para que funcione el intercambiador. La zona flexible suele estar asociado a la presencia de prolinas (en este caso 36), que establecen un contacto especial con la cardiolipina.

Cambio conformacional de la AAC: La unión de ATP por el lado de la matriz rompe el puente salino entre Arg236 y Glu264. Esto desplaza la red de pdH estabilizando su conformación. La unión de S cargados negativamente perturba los puentes salinos en el fondo de la cavidad, desplazando la red de interacciones polares. La participación de hélices TM se ayuda de prolinas que unen las hélices impares. Dímero mediado por cardiolipina: La cardiolipina es un lípido muy especial porque está compuesto de 4 ácidos grasos. Como se sabe, los lípidos interaccionan con las proteínas, y este es el caso de la cardiolipina, que se une al AAC. Todavía no hay una secuencia de aa identificada que medie esa unión. Cuando se purifica con detergentes la AAC se ve que queda un hueco. Este hueco está provocado porque el detergente desplaza a la cardiolipina de su sitio de unión. Se sabe que este hueco se corresponde a la cardiolipina porque en un medio con cardiolipina se llena en seguida.

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