15. Transporte activo primario PDF

Preview

Summary

Biofísica - Membranas y transporte...

Description

Biofísica

Tema 15. Transporte activo primario: Dentro del transporte activo encontramos el primario y el secundario. El primario traduce la hidrólisis de ATP en gradientes iónicos, mientras que el secundario se vale de los gradientes iónicos generados por el transporte primario para poder incorporar o expulsar otros solutos en contra de gradiente. En este capítulo hablaremos del transporte activo primario, por el cual los solutos atraviesan la membrana contra un gradiente de concentración, con el consecuente gasto de energía. En la mayor parte de los casos se genera un gradiente de protones por hidrólisis de ATP mediante ATP hidrolasas de membrana, bombas de ATP o ATPasas. Muchos procesos celulares dependen de la energía acumulada en forma de gradiente de iones generados por el transporte activo. Todas las células, sin excepción, mantienen un gradiente iónico entre el interior y el exterior de la célula, denominado potencial de reposo, con un valor de -70mV, negativo dentro, de manera que hay cationes en exceso fuera. La capacitancia de la membrana es muy baja, de manera que la facilidad para la generación de potenciales es muy grande. Las funciones que realizan estos gradientes son de diversa naturaleza: quimiosmótico (consumo/flujo de salida de nutrientes, metabolitos o sales), regulación del volumen osmótico (el agua sigue a los iones), químico (síntesis de ATP dirigida por H+ (Na+), homeostasis celular (regulación del pH, flujo de salida o secuestración de solutos tóxicos), transducción de señales (entrada de calcio y APs), o mecánico (rotación flagelar dirigida por H+).

Los tipos de gradientes más representativos son: 1. Quimiosmóticos: diferencias de presión osmótica que es mediada por diferencias de concentración de sustancias químicas, como iones, puesto que al tiempo que se transporta el ion, también lo hace el agua. 2. Químicos: se emplean para fenómenos mecánicos, como los flagelos de las bacterias, que muestran un rotor similar al de las ATPasas F0-F1, cuyo giro es permitido por el gradiente de H+.

Diversidad de las bombas: Dentro del transporte activo primario hay diferentes fuentes de energía como la luz (organismos fotosintéticos), el potencial redox (de la cadena respiratoria), la descarboxilación o el pirofosfato, pero la más común es la hidrólisis de ATP.

152

Biofísica Las ATPasas son universales, utilizan el gradiente de protones para cubrir el gasto energético que supone hidrolizar ATP y así transportar iones y soluto. Cada clase de bombas tiene un origen evolutivo y estructura distintos. Es por eso que cada una utiliza una fuente de energía distinta para movilizar diferentes iones. La más sencilla estructuralmente es la bacteriorrodopsina (BR), cuya estructura 7 TM descrita por Richard Henderson, que transporta protones empleando luz como fuente de energía. Las bacterias que viven en medios alcalinos generan un gradiente de sodio al bombearlo con descarboxilasas transportadoras. Otras utilizan fosfato como fuente de energía pero en forma de pirofosfato, este transporte se da en vacuolas de plantas, en hongos y en bacterias. La halorodopsina, que utiliza como fuente de energía la luz, es de las pocas bombas que transportan aniones, casi siempre se transportan cationes.

Tipos de ATPasas: Tradicionalmente, se distinguían las de tipo P (un intermediario se fosforila en el ciclo catalítico del transportador), las de tipo V (encontradas en vacuolas) y las de tipo F (reciben su nombre e que Efrain Racker, el primero que las estudió con detalle, encontró un factor fundamental para la OXPHOS, y la llamó F1. F0 es porque es sensible a la oligomicina). Los tipos V y F son bastante parecidos, por lo que se unieron en una sóla familia (F0F1). Más tarde, se descubrió la familia ABC, muy extensa. Por tanto, las nuevas clasificaciones incluyen estas tres familias de ATPasas: 1. Tipo P. 2. Tipo F/V (F0F1). 3. Tipo ABC.

153

Biofísica ATPasas tipo P (cotransporte): Recibe su nombre porque es el único grupo de ATPasas que como intermediario de su reacción es fosforilado. La hidrolisis de ATP conlleva la fosforilación de esta proteína. Las otras no pasan por la transferencia del grupo fosforilo a ningún aa de la propia proteína. Este tipo son dímeros formados por dos subunidades, lo que no es siempre cierto. Hay algunas que solo tienen 2 subunidades α, siendo las subunidades β las que no aparecen siempre. La primera que se aisló fue la de calcio, luego la de Na+/K+ que solo está cristalizada en un único intermediario, y finalmente la SERCA que es de la que se tiene mayor información estructural, ya que se consiguieron cristalizar en 6-8 intermediarios del ciclo funcional. La SERCA (sarcoplasmic endoplasmic reticulum calcium) utiliza al SER como almacén de calcio, intercambiando 2Ca2+ por 3H+ (este dato varía mucho, no es seguro). Cabe mencionar que existe un tipo de ATPasa de tipo P que transporta lípidos (una flipasa o una flopasa), lo que es muy inusual. ATPasas tipo F/V (F0F1) (uniporte): Esta familia de ATPasas tiene 8 o más subunidades. El F0 tiene como subíndice un 0 porque es la abreviatura del inhibidor que hace que se bloquee la actividad (oligomicina). F1 es el primer factor proteico de proteínas transportadoras que se aisló. Este factor es básicamente externo, por lo que si pegas un choque de sal te quedas con la subunidad aislada/separada del resto. Las ATPasas V son de ribososomas, bacterias, mitocondrias y cloroplastos. En la familia V nos falta el tipo A de arqueobacterias. Antes la V y la A estaban separadas en dos y ahora la de arqueobacterias es un subtipo aparte. ATPasas tipo ABC (simporte): Es la familia más heterogénea, aunque el perfil global estructural es similar para todas ellas. Se localiza tanto en la membrana plasmática como en el retículo endoplasmático y, transporta muchas cosas diferentes: proteínas enteras, oligopéptidos, fármacos (te vuelves resistente a toda droga que mete, transporta estas sustancias para eliminarlas de la célula en los procesos de detoxificación) y lípidos de membrana.

Herramientas para el estudio de bombas: Tener un inhibidor específico de una proteína siempre es deseable para su estudio. o

Glicósidos cardíacos (ouabaina): son derivados de azúcares que, formando un enlace acetal, se unen a un alcohol no azúcar. En algunas plantas (digital) son glicósidos cariotónicos, estimulantes de la contracción cardíaca. Actualmente no se usan. Son inhibidores de la Na+/K+ ATPasa.

o

Omeprazol: inhibidor de la H+/K + ATPasa. Es inhibidor específico de la ATPasa que acidifica el jugo gástrico. El jugo gástrico es básicamente HCL (pH=1.0) y hay una enzima en la parte apical de las células epiteliales que recubren el estómago que intercambia protones por potasio (hay compensación eléctrica), acidificando, así, el medio.

o

Oligomicina: no se usa como agente terapéutico, porque resulta mortal. Inhibidor F0F1-ATPsintasa.

Hablaremos, sobre todo, de las ATPasas tipo P que se llaman tipo P porque al hidrolizarse el ATP a ADP, el fosforilo resultante se une covalentemente a una subunidad de la ATPasa. Hay bastantes: 154

Biofísica o o o o o

Membranas plasmáticas de plantas, hongos y bacterias (bomba H+). Membranas plasmáticas eucariotas (Na+/K+). Membranas plasmáticas apicales del estómago de mamíferos (H+/K+). Membrana plasmática de todas las células eucariotas (Ca, Cu, metales pesados). Membrana del SR músculo Ca+2: SERCA.

ATPasas de la familia F0F1: o

o

o

ATPasas tipo F: ATP sintasas. F1 lleva a cabo la síntesis/hidrólisis del ATP y el F0 se encarga del transporte reversible de protones. o Membrana plasmática bacteriana. o Membrana interna mitocondrial: recibe el nombre de ATPasa, aunque debería ser ATP sintasa. o Membrana de los tilacoides del cloroplasto. ATPasas tipo V: acidifican compartimentos: o Membranas vacuolares de plantas, levaduras y hongos. o Membranas endosomales y lisosomales. o Membrana plasmática de osteoclastos y células de túbulos renales. Diferencias: o Las V sólo son bombas de protones y no pueden sintetizar ATP; es decir, no son irreversibles. o V1 aislado no tiene actividad ATPasa. o V son irreversibles. o V0 aislado no transporta protones. o 1-2 H+/ATP hidrolizado.

En las tipo F, el conjunto de subunidades c forma un rotor de manera que según van entrando los protones, va girando (observación experimental). Modelo: o o

Entrada de protones – rotación sentido horario de gamma – síntesis de ATP  F sí, V no. Hidrólisis de ATP – giro antihorario de gamma – bombeo de protones  F sí, V sí.

Ahora, secuenciando miles de organismos, podemos saber algo más sobre la filogenia de estas bombas: o o o o

Las ATPasas tipo V son las formas ancestrales. Los genes de la F aparecen por diferencia en las eubacterias al separarse de las arqueobacterias. Las arqueobacterias sólo tienen V. Los eucariotas reciben las V del ancestro común y las F cuando la endosimbiosis de eubacterias dio origen a mitocondrias y cloroplastos. Algunas eubacterias tienen aún ATPasa tipo V. Las arqueobacterias tienen ATPasas tipo V y funcionan como ATP sintasas.

Otras características de estas ATPasas: o o

Hay plantas que en sus vacuolas bombean protones mediante la ruptura de PPi en lugar de ATP. La energía de hidrólisis es la misma, porque el enlace es el mismo. En general, hay dos estrategias para bombear protones más eficientemente, siempre conservando la neutralidad eléctrica: o Establecer un movimiento de aniones en la misma dirección (simporte de aniones): vacuolas. 155

Biofísica o

Establecer movimiento de cationes en dirección contraria (antiporte de cationes): células del estómago.

Este es un pequeño modelo resumen. El canal iónico de cloruro o nitrato mantiene la neutralidad eléctrica. Vemos también la opción de no hidrolizar ATP, sino obtener la energía de la hidrólisis de pirofosfato.

ATPasa tipo P: Están presentes en eucariotas y bacterias. Son transportadores de cationes, fosforiladas reversiblemente por ATP como parte del ciclo de transporte. El genoma humano codifica al menos 70, todas muy similares entre ellas. Son proteínas integrales de membrana, con 8-10 hélices transmembrana en una sola cadena polipeptídica. Interesantemente, desde el punto de vista del investigador, se inhiben por vanadato, mediante inhibición competitiva, ya que es análogo estructural del fosfato. Se trata de una gran familia de proteínas que principalmente bombean iones (cationes) aunque hay un tipo específico que también bombea lípidos. Atendiendo a su estructura, de la región transmembrana grande, lo que caracteriza a estas ATPasas es la subunidad α, la subunidad β es opcional (SERCA no la tiene). Posee también una región citoplásmica pequeña compuesta por 3 dominios, cada uno con una función distinta. El ATP hidrolizado, en uno de los dominios citosólicos, se utiliza para transferir el grupo fosfato a residuos de aspártico, en una secuencia muy conservada, como parte del ciclo de transporte. Esta fosforilación es estrictamente necesaria para el funcionamiento del transporte. Como parte del proceso de transporte. En la subunidad α, se encuentra el centro de unión al AMP (bolitas rojas). La unión a los iones va a estar localizada hacia la mitad de la membrana. Las ATPasas tipo P que involucran los cationes de interés directo para generar un desbalance entre sodio-potasio o concentrar calcio, se intenta contrabalancear el movimiento de cargas para no variar en gran medida el potencial. En el que más movimiento de protones hay es en el SER porque es permeable a los protones. Esta familia de ATPasas está inhibida por vanadato, un análogo del grupo fosfato. Su unión al centro de unión del fosfato provoca un cambio conformacional que paraliza el intermediario fosforilado, por lo que la reacción no ocurre, no hace el transporte funcional. Na+K+ ATPasa: Es una ATPasa de tipo P cuyo papel principal es mantener las concentraciones intracelulares de Na+ y K+. Para ello, saca 3 Na+ fuera y mete 2 K + dentro, utilizando un gradiente de Na+ para el cotransporte. Este transporte genera una separación de cargas a través de la membrana, por lo que esta bomba contribuye a mantener el potencial de membrana (importante en la señalización eléctrica en neuronas). Presenta una especie de dicotomía, porque se dedujo con estudios bioquímicos que existía un intermediario fosforilado, pero al final no solo era uno sino 2. Además se daba un cambio conformacional entre las dos formas de intermediario fosforilado. 156

Biofísica Jens Skou, Premio Nobel de Química en 1997, fuel el que descubrió esta ATPasa en 1957. Fue la primera proteína transportadora conocida y, por supuesto, la primera ATPasa. Si las de la familia F tienen más de 8 subunidades, las de tipo P tienen 2 subunidades, distintas entre sí, por tamaño. La subunidad grande tiene los centros de unión de sodio y potasio. Los inhibidores se unen donde lo hace el potasio. Las KM son diferentes fuera y dentro. J Skou descubre esta proteína que hidroliza ATP en presencia de Na+, K+ y Mg+2. El magnesio ayuda a liberar los nucleótidos del centro de unión una vez completado el ciclo (el ATP está en la célula como sal magnésica) El transporte de iones y la hidrólisis de ATP requiere Na + y ATP dentro (ambos compiten por el centro de unión), y K+ fuera. La ouabaina inhibe sólo desde fuera y compite con el potasio en el centro de unión. El vanadato (análogo al Pi) inhibe sólo desde dentro. Los resultados de Skou indican que: o

o

o

En ausencia de magnesio, el ATP se une, pero no se hidroliza. La cantidad de magnesio requerida es la misma que la de ATP, por lo que el sustrato es Mg-ATP. En ausencia de sodio (con potasio y magnesio), el ATP se une con menor afinidad y tiene una hidrólisis lenta. En ausencia de potasio (con sodio y magnesio), el ATP se hidroliza muy lentamente.

En vista de los resultados, se procedió a precipitar con perclórico en presencia de 32Pi. Gracias a la señal radiactiva, analizando la secuencia, se ve que hay un aspártico fosforilado, por tanto existe al menos un intermediario fosforilado del transportador. Sabiendo que la unión de ATP y la transferencia de Pi al aspartato requieren de Mg2+ , y que la hidrólisis del transportador fosforilado (E-P) requiere de K+ (ya que desfosforila al intermediario fosforilado), se propuso el siguiente modelo:

Eso quiere decir que la fosforilación no requiere potasio, y la desfosforilación no requiere sodio. No obstante, posteriormente se descubrió que eran dos los posibles intermediarios E-P. Se observó que había dos poblaciones E-P diferentes, una que se desfosforilaba por potasio y otra por ADP. La fracción sensible al ADP aumenta al incrementarse la concentración de sodio o añadiendo NEM. Además, se comprobó que las poblaciones eran una, ya que cuando aumenta la fracción sensible al ADP, disminuye la sensible al K. El modelo es:

157

Biofísica

En este nuevo esquema se mantiene el hecho de que la fosforilación del transportador es dependiente de Na+ y Mg2+. Sin embargo, ahora se muestran dos intermediarios fosforilados (E-P): uno sensible al ADP y depende de la concentración de Na+, y el otro es sensible al K+. El NEM modifica algunos grupos implicados en la transformación de E1 a E2 y el balance E1-E2 está controlado por la [Na+]. La ouabaina, en cambio, tiene afinidad por E2-P y se une en el mismo centro de unión de los K +, inhibiendo así la reacción de desfosforilación y provocando la estabilización de E2-P incluso en presencia de K+. A continuación se somete a hidrolisis con tripsina la enzima E1 en un medio rico en sodio, y E2 en un medio rico en potasio. Los puntos de la enzima donde la tripsina era accesible eran diferentes en cada uno de los medios, lo que indica que de E1 a E2 se da un cambio conformacional que hace que se expongan al medio diferentes aminoácidos en la estructura secundaria. Además, el intermediario presente en el medio enriquecido con sodio, es afín a sodio, muestra que es sensible a la desfosforilación por ADP pero no por potasio. Por el contrario, el intermediario presente en el medio rico en potasio, es un intermediario afín a potasio y, es sensible a desfosforilación por potasio pero no por ADP. Todo esto sugiere que existe un cambio conformacional entre ambos intermediarios. En la siguiente tabla se muestran las propiedades de las conformaciones E1 y E2 de la Na+/K+ATPasa:

Baja fluorescencia intrínseca: es otro método sencillo y bastante eficiente para observar cambios conformacionales en enzimas. Existen 3 aminoácidos que emiten fluorescencia. El que tiene mayor rendimiento cuántico es el Trp y, además, cambia la longitud de onda de emisión en función de la polaridad del medio, perfectamente medible con un espectrofluorímetro (en medios apolares la fluorescencia es mayor). Por tanto, si vemos que al añadir sodio o potasio aumenta o disminuye, podemos sospechar un cambio de conformación, porque quiere decir que algún triptófano de la proteína pasa de medios polares (superficie) a medios apolares (core) o viceversa. Ciclo catalítico Na+/K+ ATPasa: Skou, Post, Alberts y otros (190-1970) demostraron que la reacción de la Na+/K+ ATPasa ocurre en varias etapas: 1. Transferencia del fosfato terminal del ATP a un residuo aspartato de la enzima, en presencia de sodio y magnesio (no potasio). 2. La enzima fosforilada sufre un cambio conformacional E1-E2 (inhibido por oligomicina y NEM). 158

Biofísica 3. La enzima se desfosforila liberándose Pi, en presencia de potasio y magnesio (inhibido por ouabaína). 4. La enzima pasa de E2 a E1.

Mecanismo del transporte activo: 1. Tres iones Na+ se unen con alta afinidad a sitios de unión en el lado citoplasmático de E1, y un ATP se une (acomplejado con Mg+2) al sitio de fosforilación. 2. El ATP se hidroliza a ADP y el grupo fosfato es transferido a un grupo aspartato del enzima (E1-P). Esta fosforilación activada por el Na+ le da al enzima una conformación "ocluida" donde los iones quedan "encerrados" en el interior. 3. La ATPasa sufre un cambio conformacional desde E1-P al estado E2-P, más estable. Ese cambio conformacional es inhibido por oligomicina y NEM. 4. Esta nueva conformación del encima es menos afín a los Na+, por lo que son transportados a través de la proteína hasta ligarse débilmente a sitios que se forman en el lado externo de la membrana y se liberan al exterior. 5. La forma E2-P del enzima es de baja energía y de alta afinidad a K +. La unión de dos de estos iones a sitios extremos de la proteína acelera sus desfosforilación, liberándose un Pi. Esta desfosforilación es inhibida por ouabaina. Como consecuencia, se da un cambio conformacional de E2 a E1. 6. En el nuevo estado E1 la enzima es poco afín a K +, por lo que los iones pasan a través de la bomba y son liberados al citoplasma. Esta liberación de los K+ hace que la enzima vuelva a ser susceptible de unión a ATP y Na+, cerrando el ciclo. Por lo que vemos, la Na +/K+ ATPasa tiene un mecanismo de acción cíclico, durante el cual sufre cambios conformacionales donde la proteína expone alternadamente los sitios de unión de estos iones a uno y otro lado de la membrana. Por cada ciclo entran 3Na+ y salen 2K+. La Na+/K+ ATPasa está compuesta por dos subunidades: una subunidad α de 110kDa (1000aa), y un glicopéptido β más pequeño, de unos 55kDa. La subunidad α contiene el aspárico fosforilable y el sitio de unión a ouabaina, es decir, las funciones catalíticas están en esta subunidad. La estructura primaria de ambas subunidades fue deducida a partir de la secuencia de cDNA de células de órgano eléctrico (electroplax) de la Raya torpedo. La cadena α está muy conservada y está constituida por 10 hélices TM unidas por 5 asas extracelulares cortas. La fosforilación ocurre en un residuo Asp (369 en humano y 376 en electroplax) en un bolsillo de 7aa que contiene la secuencia Asp-Lys-Thr-Gly-Thr (presente en todas las ATPasas tipo P), a 30 residuos del término de M4. Hay

159

Biofísica un gran rizo (loop) c...