20 - Clonage - Notes de cours 20 PDF

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Note de cours...

Description

Clonage Définition Clonage cellulaire -

Isoler une cellule Multiplier une cellule → clone de cellules identiques

Clonage moléculaire -

Isoler un gène ou un fragment de gène Multiplier un gène ou un fragment de gène

Clonage embryonnaire Technique permettant d’obtenir des embryons identiques à partir des noyaux de cellules d’un donneur placés dans un ovule énuclée -

Finalité reproductive : ovule implanté dans l’utérus pour produire des animaux identiques Finalité thérapeutique : pas d’implantation, clonage reproductif interrompu pour obtenir des cellules souches compatibles avec le donneur (greffes…)

Clonage VS sous-clonage -

Clonage : on sélectionne un fragment d’ADN qu’on clone puis qu’on insère dans un fragment Sous-clonage : sélection d’un fragment qu’on insère dans un vecteur puis qu’on clone

Objectifs du clonage moléculaire Amplification : séquençage, étude de la structure des gènes/acides nucléiques, étude de l’homologie entre les différentes espèces, détection de mutations ou mutagénèse Expression : étude de la transcription/traduction, étude de la régulation de la transcription (promoteurs), production de protéines/ARN, évaluation de l’effet d’une mutation sur un phénotype

Étapes du clonage moléculaire

1) Préparation de l’ADN Fragment de taille comprise entre 0 et 23 Mb -

Lyse cellulaire : sonication ou traitement hypotonique Élimination d’autres molécules : ARN (RNAse), protéines (protéases, phénol), lipides (chloroforme/eau) Précipitation (élimination de sels) et concentration (éthanol) Fragmentation par enzymes de restriction → Sélection du fragment par : électrophorèse sur gel d’agarose, chromatographie (HPLC), centrifugation à gradient de densité, PCR → Pas de sélection : clonage de la totalité des fragments (sélection à postériori et sous-clonage)

Origine du fragment et traitement :

Méthode d’obtention d’un cDNA à partir d’un ARNm dont on ne connait pas la séquence (après purification)

2) Préparation du vecteur de clonage

3) Préparation du rDNA (= ADN recombinant) : union du fragment ADN (= insert) et du vecteur (= vecteur recombinant) par la ligase T4

Stratégies pour éviter la re-circularisation du vecteur : -

Couper avec deux enzymes différentes Ajouter la phosphatase alcaline pour déphosphoryler le vecteur (2 extrémités 3’OH et 2 extrémités 5’OH) Utilisation de vecteur TA linéaire

4) Incorporation du rDNA dans la cellule hôte → réplication du vecteur, production de clones bactériens Type de cellules hôtes : -

Procaryotes : E. Coli → transformation Eucaryotes (→ transfection ou injection si ovocyte de xénope) : levure (études de régulation de l’expression génique), cellules animales (HeLa, fibroblastes, ovocytes…)

Méthodes de transformation/transfection -

physico-chimiques : CaCl2 à 0°C + 37-43°C (choc thermique) passif : interaction ADN-cations (CaPO3, DEAE-dextrane), polymères (PEG) liposomes électroporation : pulses électriques (ouverture de pores dans la mb) micro-injection infection/transduction (vecteurs viraux) endocytose

5) Propagation cellulaire Multiplication des clones cellulaires

6) Sélection de cellules ayant incorporé le vecteur recombinant 3 méthodes de détection et sélection : -

Hybridation : sonde marquée qui détecte une séquence d’ADN cloné ou d’ARNm transcrit Immunochimie : Ac spécifique contre la protéine codée Phénotypique : le clone code → Une protéine détectable (ex : β-gal) → Une protéine de résistance aux antibiotiques : β-lactamase (ampicilline), tet-A (tétracycline) → Un complément nutritionnel : TRP1 (biosynthèse de Trp)

7) Expression de l’ADN cloné (optionnel)

Utilisation de vecteurs d’expression Clonage du gène complet, comprenant le promoteur + protéines de fusion (= autre promoteur) Ex : production de l’insuline avec promoteur β-gal et protéine de fusion βgal-insuline

Les banques ADN Collection de tous les clones obtenus par fragment de l’ADN de cellules ou de tissus. Mêmes étapes que pour le clonage. Selon l’ADN de départ : -

Banques génomiques : à partir de l’ADN total Banques de cDNA : à partir de l’ARNm total

Réplication de chaque colonie dans un puits de microplaque (384 puits/plaque). Étape critique : localisation du clone contenant l’ADN d’intérêt.

Taille des banques génomiques Probabilité de trouver une séquence donnée dans une banque :

N=

ln (1−P) ln (1−f )

avec N nb de

recombinants (nb de colonies), p probabilité désirée et f proportion de génome dans un seul recombinant

Construction d’une banque d’ADN génomique Banque d’ADN génomique : ensemble de vecteurs recombinants (ici bactériophages) contenant la totalité du génome d’une espèce 1) Construction de l’ADN recombinant (phage + ADN étranger) 2) Encapsidation de l’ADN recombinant dans des phages → obtention de bactériophages recombinants 3) Infection de bactéries étalées sur gélose

4) Analyse de la banque (ensemble des phages ou plage de lyse)

5) Multiplication du fragment cloné Phage positif (phage de lyse) utilisé pour infecter une culture de bactéries → obtention de phages à partir desquels on obtient l’ADN d’intérêt

Construction d’une banque de cDNA

Transformation des bactéries et analyse de la banque -

Analyse globale : concerne tous les clones, isolement des plasmides et séquençage de l’ADN inséré Analyse ciblée : transfert des colonies et hybridation, identification du clone d’intérêt et séquençage

Clonage par PCR...