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Relatório prático de analise microbiologia da ração...

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Universidade Federal de Mato Grosso- UFMT

Fernanda

Procedimento de análise microbiológica da ração

Cuiabá, 2017 Fernanda Araujo Hipolito

Apresentação de relatórios técnico-científicos

Relatório técnico apresentado como requisito parcial

para

disciplina

obtenção

de

de

Microbiologia,

aprovação

na

no

de

Curso

Zootecnia, na Universidade Federal de Mato Grosso. Prof.

Phd.

Msc.

DVM

Luis

Carlos

Ona

Magalhães

Cuiabá, 2017 2

RESUMO

Este trabalho tem por finalidade analisar e identificar o agente causador da alteração da amostra de ração, a qual aparenta possuir características de cor esverdeada, aparência aveludada e com odor diferenciado. Por meio desta, realizou-se experimentos de análise microbiológica. Cada procedimento tem como objetivo interpretar e investigar cuidadosamente o motivo da contaminação. O resultado do experimento permite recorrer o tratamento contra agente etiológico contido na amostra de ração para assegurar a qualidade.

Palavras-chaves: Análise microbiológica; Amostra de ração; Procedimento; Resultado do experimento.

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SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO....................................................................................................5 2. DESENVOLVIMENTO........................................................................................7 2.1 OBJETIVO GERAL.....................................................................................7 2.1.1 Objetivos específicos..................................................................................7 2.2

PREPARO DE MEIO DE CULTURA........................................................7

2.2.1 Materiais..................................................................................................7 2.2.2 Procedimento experimental.....................................................................8 2.3

DILUIÇÃO SERIADA..............................................................................10

2.3.1 Materiais.................................................................................................10 2.3.2 Procedimento experimental....................................................................10 2.4

TÉCNICA DE SEMEADURA..................................................................11

2.4.1 Materiais.................................................................................................11 2.4.2 Procedimento experimental.....................................................................11 2.5

MÉTODO DE COLORAÇÃO..................................................................12

2.5.1 Materiais.................................................................................................12 2.5.2 Procedimento experimental....................................................................12 3. RESULTADOS..................................................................................................14 4. CONCLUSÃO...................................................................................................15 5. REFERÊNCIAS.................................................................................................16

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1. INTRODUÇÃO O processo de análise microbiológica tem como função descobrir o agente etiológico causador da alteração da aparência, cor e cheiro da amostra de ração, com isso, necessita-se de empenho, experiência e técnicas laboratoriais para a garantir resultados da coleta da amostra. Análises de amostras são usualmente utilizadas para a tomada de decisões, quer seja para liberar um lote de produto para comercialização ou para aceitar um lote de produto comprado. Uma amostra deve ser representativa e de tamanho suficiente. A forma como é coletada é muito importante, pois deve minimizar qualquer tipo de influência sobre ela. Para assegurar a qualidade da amostragem, empregam-se os planos de amostragem. (Destro) Os planos de amostragem iniciam-se no processo de coleta da amostra de ração, necessita-se realizar primeiramente o processo de aliquotagem para que seja possível utilizar vários tipos de analises microbiológicas em uma única amostra. Além disso, “quem coleta o material deve ser devidamente treinado e periodicamente reciclado nesta atividade. Deve saber que o material deverá ser destinado, o mais brevemente possível, ao laboratório. Deve conhecer ou obter instruções sobre conservação e/ou transporte do material caso este não possa ser realizado imediatamente” (ANVISA). A determinação do meio de cultura também influencia no resultado da amostra, nela contém nutrientes necessários para o crescimento do microrganismo a fim de ser estudado. Ademais, para estabelecer com exatidão os resultados, necessita-se realizar técnicas laboratoriais, como de semeadura, repique, diluição seriada e método de coloração de Gram para descobrir que tipo de microrganismo está presente na ração, como bactéria, fungo ou protozoário.

Desta maneira, as técnicas de analise microbiológica são descritas em: 5

1. Técnica de semeadura: Semear um microrganismo é colocá-lo em um ambiente

adequado,

em

meio

de

cultura

apropriado

ao

seu

desenvolvimento e reprodução. Ao semear um germe, é preciso levar em conta as técnicas de assepsia nas manipulações, esterilidade do instrumento e dos meios de cultura empregados. (MACIEL, 2005) 2. Diluição seriada: Consistem diluir o conteúdo da primeira amostra, a fim de observar a concentração. 3. Método de Gram: A coloração é um dos passos mais importantes para a identificação bacteriana. A finalidade é facilitar a observação microscópica

das

bactérias

e

diferenciá-las

quanto

às

suas

características morfotintoriais. (MACIEL, 2005)

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2. DESENVOLVIMENTO 2.1 OBJETIVO GERAL Objetivo deste trabalho é descobrir o agente causador da alteração nas características da ração. 2.1 1 Objetivos específicos  Promover análise da amostra;  Determinar o tipo de microrganismo presente; 2.2 PREPARO DE MEIO DE CULTURA MATERIAIS  Água destilada 1000ml;  Balança analítica;  Placas de Petri  Béquer;  Erlenmeyer;  Pisseta;  Copos pequenos descartáveis;  Bastão de vidro;  Autoclave; COMPOSIÇÃO DE MEIOS BÁSICOS: Ágar nutriente:  Extrato de carne 3g  Peptona 5g  Cloreto de sódio 7

 Água destilada 100ml Ágar Martin:  Corante rosa Bengala 0,03g;  Glicose 10,0g;  Peptona 5,0g;  KH2PO4 0,5g;  K2H2PO4 0,5g;  MgSO4.7H2O 0,5g;  Estreptomicina 0,03g;  Extrato de levedura 0,5g;  Ágar 15,0g;  Água destilada; 2.2.1 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL A princípio houve um ajuste nos valores dados para a realização do experimento, sendo assim, cada reagente foi calculado e dividido por 4, com isso, atribuiu-se novos resultados para a composição descrita acima. Os resultados após o cálculo foram: 

Glicose 2,5g;



Peptona 1,25g;



KH2PO4 0,125g;



K2H2PO4 0,125g;



Rosa bengala 0,0075g;



Esptreptomicina 0,0075g;



Agua destilada 250ml;



Ágar 7,5g;



Extrato de levedura 0,125g;



MgSO4.7H2O 0,125g;

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No decorrer do experimento, estabeleceu-se grupos para medir os compostos químicos, logo os reagentes foram transferidos para outra sala. Inicialmente, a balança foi zerada juntamente com o copo descartável de 50ml numerado. Posteriormente, cada reagente foi pesado separadamente. Os reagentes, após serem pesados, foram passados para o béquer por etapa. Antes de adicionar os ingredientes, manuseou-se a pisseta para adicionar 250ml de água destilada na proveta, feito isso, adicionou-se 100 ml no béquer. Em seguida, foi adicionado cada composição por etapa, e com auxílio o bastão de vidro, agitou-se para evitar o surgimento de espuma. Após a homogeneização, a solução foi transferida para o Erlenmeyer e o resto de água ainda presente na proveta foi sendo adicionada para desagregação dos resquícios no béquer. Em seguida, o produto foi submetido a movimentos circulares por cerca de 5 minutos para garantir fixação da mistura. Por fim, deixou-se por 15 minutos na autoclavagem à temperatura de 125ºc para realizar a esterilização. Feito isso, esperou esfriar 50ºc e distribuiu-se assepticamente nas placas de Petri, a qual foi deixada para solidificar na bancada em temperatura ambiente, logo foi adicionado a estreptomicina e feita a homogeneização. Após a montagem da placa de Petri, as placas foram colocadas na geladeira por aproximadamente 12h na temperatura de 10ºc.

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2.3 DILUIÇÃO SERIADA 2.3.1 Materiais: 

Pipetador automático;



9ml de agua peptonada;



Rosa bengala;



Tubos de ensaio;



Pisseta;



Ponteira;



Almofariz;



Pistilo;



Ração 25g;

2.3.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Para a determinação da diluição seriada, realizou-se a assepsia nas bancadas e nos materiais a fim de ser utilizados, e também, a higienização das mãos. Em seguida, para facilitar a identificação, etiquetou-se todos os tubos com números de 1 a 5. A ração foi colocada no almofariz e moída com o pistilo, logo acrescentou 0,1%ml de agua peptonada para realizar a homogeneização. Após feita mistura, com auxílio do pipetador, foi coletada 1ml da amostra e transferida para o tubo de ensaio contendo o mesmo diluente. Em seguida, adicionou-se 9ml de caldo nutriente em cada tubo de ensaio com pipetador automático. No tubo 1, foi adicionado 1g da ração pesada anteriormente. Após se esperar cerca de 2-3 minutos, 1ml dessa solução foi adicionada ao tubo 2 com auxílio do pipetador. O tubo 2 foi homogeneizado, e em seguida foi pipetado 1ml da sua solução ao tubo 3. Esse mesmo procedimento foi feito também nos próximos tubos, tendo assim, uma série de soluções diluídas a partir da suspensão original. Ao finalizar cada coleta sequencial, as ponteiras foram sendo descartadas para não influenciar volume exato de cada amostra. Por fim, os frascos foram pareados para analisar a diluição.

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2.4

TÉCNICA DE SEMEADURA 2.4.1 Materiais 

Placa de Petri contendo meio de cultura;



Alça de platina;



Estufa com temperatura 37 a 40ºc;



Filme de pvc;



Bico de Bunsen;



Alça de drigalski;

2.4.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Inoculação de bactéria: No início do experimento, as placas de Petri contendo diferentes meios de cultura, foram devidamente identificadas. Com auxílio de um marcador, cada placa foi identificada com números de 1 a 5, uma para cada tubo de ensaio com diferentes diluições. Após a higienização das mãos, perto do bico de Bunsen, foi coletado com alça bacteriológica microrganismos presentes na primeira diluição no tubo de ensaio. Posteriormente, o contendo o material foi inoculado na placa de Petri, com movimentos de zig-zag em cada marcação. O mesmo processo foi feito com os demais tubos de ensaio para realizar a inoculação dos microrganismos na placa. As placas de Petri foram envolvidas com papel plástico e levadas a estufa com temperatura de 37 a 40ºc. Ao incubar as amostras, as placas foram invertidas, e após 24 horas, foram observadas o resultado das inoculações dos microrganismos presentes na placa. Inoculação de fungos: Para contagem de bolores e leveduras, a partir da primeira diluição, coletou-se 1microlitro da amostra com auxílio de um pipetador. Feito isso, colocou-se um volume de 0,1ml em cada placa de Petri contendo meio de cultura Ágar.

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Em seguida, manuseou-se a alça de drigalski, perto do bico de Bunsen, flambou e esperou esfriar para realizar o espalhamento no meio de cultura. O procedimento foi feito com as demais placas identificadas com números de 1 a 5. Por fim, deixou-se na estufa à temperatura de 25ºc por cinco dias. Método de análise de protozoário: O mesmo processo de inoculação ocorreu para análise de protozoário. A observação no microscópio foi feita com maior grau de aproximação para observar a motilidade, identificar e conferir a presença do protozoário. Repique para determinação de fungo ou bactéria: Por fim, após realizar a inoculação dos microrganismos, foi feito o método repicagem. Pegou-se a alça de platina, esterilizou, passou em movimentos zig-zag e transferiu o material coletado para uma nova placa de Petri, devidamente identificadas, contendo meio de cultura. Em seguida, após serem vedada, as placas foram levadas à estufa de crescimento por 24h a 48h para observação. 2.5

METODO DE COLORAÇÃO DE GRAM 2.5.1 Materiais 

Placa de Petri contendo meio de cultura;



Pipeta de Pasteur;



Microscópio;



Recipiente de vidro;



Pinça de madeira;



Luvas;



Pisseta;

2.5.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Inicialmente, ocorreu métodos de higienização. Lavou-se bem as mãos e promoveu a desinfecção das bancadas e materiais. Após feita a limpeza, iniciou-se o processo do esfregaço, sendo assim, com auxílio da pipeta de Pasteur, pingou-se uma 12

gota de água destilada na lâmina, colheu-se com a alça bacteriana, já esterilizada no bico de Bunsen, uma porção de microrganismo da placa de Petri na superfície do Ágar nutriente e misturou-se com a gota de água na lâmina, até obter um esfregaço homogêneo. Ao finalizar o esfregaço, fixou-se a mistura sob a chama do bico de Bunsen. Em seguida, a lamina com o microrganismo já fixado foi levada a outra bancada. Usou-se luvas para manusear o experimento e prendeu a lamina em uma pinça de madeira e inclinou-se a lamina em um recipiente de vidro, com auxílio da pipeta de Pasteur, adicionou-se a substância violeta Gensiana, este liquido foi movimentado dentro do pote de vidro para espalhar o produto por 1 minuto. Ao passar o tempo, a lâmina foi levada rapidamente a pia para retirar o excesso com agua destilada. Posteriormente, o mesmo processo ocorreu, mas com a solução de Lugol. Esta substância foi submetida na lâmina por 30 segundos e removeu-se o excesso com agua destilada e álcool por 5 segundos. A lâmina passou por um último processo de coloração de Gram, colocou-se a substância fucsina por 30 segundos e finalizou removendo o corante com agua destilada. Deixou-se a lâmina escorrer sob a bancada até secar em um papel toalha. Por fim, levou a lâmina para observar no microscópio. A partir observação, constatou-se a presença de fungos e bactérias.

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RESULTADO O resultado do experimento nas análises microbiológicas foi observado

atentamente e com clareza. A partir da diluição foi possível identificar o grau de concentração de microrganismos, que ao ser inoculado nas placas foi permitido identificar a presença fungos e bactérias. Além disso, a escolha do meio de cultura agilizou o processo de crescimento biológico da amostra. A análise de fungos, como bolores e leveduras foram observadas a olho nu, assim como as colônias bactérias, mas para melhor observação, o método de coloração de Gram permitiu a classifica-las a partir de sua morfologia. Constatou-se Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus para fungos e Salmonella para bactérias, as que conferem em maior quantidade, as bactérias Gram negativa. Houve uma presença mínima de protozoário, com isso, prevaleceu a existência de microrganismos, como fungos e bactérias.

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CONCLUSÃO

A proliferação dos microrganismos nas amostras de ração deve-se pela falta de cuidados ao armazenar, pois a umidade e temperatura influenciam na qualidade do alimento. Com isso, a escolha dos ingredientes e a composição da produção ração influenciam no crescimento de quaisquer microrganismos. Por meio destas análises, foram identificados nos resultados um grau de infecção e micotoxinas.

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

DESTRO, Maria Teresa. Análise microbiológica de alimentos: importância de assegurar a qualidade da amostragem. Disponível em: >http://revistaalimentare.com.br/amostragem/< Acesso em: 26/11/2017 MACIEL, Elinalva. Manual da disciplina microbiologia de alimentos. Acesso em: 26/11/2017 ANVISA. Procedimentos laboratoriais: da requisição do exame á analise microbiologica. Acesso em: 26/11/2017

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