3 Tinción de Gram & Ziehl Neelsen PDF

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADORFACULTAD DE CIENCIAS MÉDICASCARRERA DE MEDICINAAsignatura: LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍAPRACTICA 3: Técnica de Tinciones de la pared Bacteriana: Gram y Ziehl-NeelsenJunio a Octubre 2020RESULTADO DE APRENDIZAJE: interpretar los resultados de las coloraciones ...

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS CARRERA DE MEDICINA Asignatura: LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA PRACTICA 3: Técnica de Tinciones de la pared Bacteriana: Gram y ZiehlNeelsen Junio a Octubre 2020

RESULTADO DE APRENDIZAJE: interpretar los resultados de las coloraciones de la pared bacteriana OBJETIVO: ✓ Comprender los pasos necesarios para realizar la tinción de Gram y Ziehl Neelsen ✓ Reconocer los microorganismos Bacilo alcohol-acido resistentes y Gram positivos y negativos, ✓ Aplicar e interpretar lo aprendido a la práctica médica diaria. TRABAJO AUTONOMO: 1.- Estudiar estructura de la pared de los Gram positivos, Gram negativos y Micobacterias 2.- Traer solicitud de laboratorio donde se solicita coloración de Gram y Ziehl-Neelsen (originales de hospitales, clínicas, públicas y privadas, etc. Nacionales, no internet) 3.- Traer reporte de resultados de coloración de Gram y Ziehl-Neelsen (originales de hospitales, clínicas, públicas y privadas, etc. Nacionales, no internet)

1.-Introducción Las bacterias normalmente son transparentes al microscopio, por lo que utilizamos coloraciones de las diferentes estructuras del microorganismo para poder visualizarlo, en esta ocasión se describirán las c l. Las coloraciones en los laboratorios de microbiología han permanecido atreves del tiempo como la piedra angular para el diagnóstico primario y han guiado el tratamiento empírico del médico, antes de tener los resultados del cultivo. La interpretación incorrecta de las coloraciones puede tener consecuencias adversas en la salud del paciente. La mayor cantidad de errores se han identificado, una mala calidad de la muestra, mala realización del frotis, mala interpretación de lo observado en la coloración e interpretación equivoca de los resultados. PREPARACIÓN DEL EXTENDIDO (frotis) En la preparación de los extendidos s microorganismos p s c s.

s del paciente o se aplican los

Por lo general las muestras se colocan sobre el portaobjeto con un hisopo, asa de siembra o un palillo montadientes que contiene el material del espécimen en estudio o con una pipeta dentro de la cual se encuentra la muestra de líquido aspirado (Fig. 1). El material que se va a teñir se coloca en forma de una gota (si la muestra es líquida), o se rota de adentro a fuera (si está en un hisopo, asa o palillo) sobre la superficie de un portaobjeto limpio y seco, en la parte media del laminilla, c r .

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B

A

Fig 1.- frotis obtenidos por rotación de un hisopo (A) y deposito con pipeta (B) de la muestra del paciente sobre un portaobjetos de vidrio.

Se deja secar al hambiente y se fija al portaobjeto mediante los siguientes procedimientos: 1).- u 2).- cubriéndolo con metanol al 95% durante 1 minuto o 3).- flameando la placa portaobjetos por el mechero en tres ocasiones

COLORACION GRAM La más útil de las tinciones es la de Gram, que separa los organismos en 2 grandes grupos dependiendo de la captación o reacción: gram-positivos y gram-negativas. La tinción de Gram es la técnica principal utilizada para el examen microscópico de las bacterias. Casi todas las bacterias de importancia clínica pueden detectarse con este método. Las únicas excepciones son: • Los microorganismos que se hallan casi con exclusividad dentro de las células huésped (p. ej., chlamydias). • Los que carecen de pared celular (p. eje., mycoplasmas y ureoplasmas). • Los que tienen un tamaño insuficiente para ser observados por el microscopio óptico (p. ej., espiroquetas). • Los que tienen una diferente composición en su pared y no captan los colorantes (p. ej., mycobacterias).

Fig. 2.- Estructura de paredes bacterianas GRAM(+) y GRAM(-).

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Esta tinción también además permite que el medico pueda determinar si el organismo tiene las siguientes características: Forma: redondo, en forma de varilla, coma, etc. Agrupación: racimos, cadenas, pares, etc. R n de gram: positiva, negativa o variable Cantidad: 1, 2, 3, etc. x campo o por +, ++, +++, ++++ E s: PMN, eritrocitos, detritus, células, etc. Un microorganismo Gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre daño de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica l re . Una posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente: El colorante básico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos gram positivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las células gram negativas, los lípidos de la pared (más abundantes que en las células gram positivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teoría, pero es indudable la importancia general de la pared celular.

Si bien la evaluación de la a como una ayuda en el diagnóstico de las infecciones bacterianas, es posible que se detecten y no deben ignorarse hallazgos inesperados pero importantes de otras etiologías infecciosas. Por ejemplo, las células y los elementos micóticos por lo general se tiñen como gram positivos pero pueden captar el cristal violeta de manera deficiente y aparecer como Gram variables (p. ej., rosa y violeta) o gram negativos.

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CAUSAS QUE ALTEREN LA COLORACIÓN DE GRAM • • •

Edad de la bacteria. (pueden perder capas de peptidoglicanos y teñirse como gram negativos) E r . (Al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se tiñan como gram negativas) Uso de antibióticos

A pesar de la gran utilidad de la tinción de Gram, este método debe ser valorado con precaución, ya que la reacción puede variar. Para mejor entendimiento de la coloración de Gram revisar: http://jcm.asm.org/content/54/6/1442.long

COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN La tinción de Ziehl-Neelsen es una l que se basa en que las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-acido, después de la tinción con colorantes básicos. Las myco s debido a la elevada proporción de c . Para acelerar la absorción del colorante fuscina y así la formación del complejo micolatofusina en la pared celular, s s. Una vez que las mycobacterias han absorbido el colorante, difícilmente lo ceden a pesar del tratamiento con solución decolorante alcohol-ácido clorhídrico. Por esto se denominan bacilos alcohol ácido resistente o BAAR y aparecen en el preparado microscópico teñidas de rojo, sl .1 Las mycobacterias no constituyen el único grupo que tienen propiedades alcohol-ácido resistentes. Las especies de Nocardia y Rhodococcus poseen una alcohol-acido resistencia parcial así como Legionella micdadei causante de neumonía. Los quistes de los géneros Cryptosporidium e Isospora tienen resistencia definida a las tinciones con ácido alcohol

LA MUESTRA. L . Sin embargo, dado que el mycobacterium puede afectar a cualquier órgano, con menor frecuencia puede requerirse la investigación de muestras muy variadas como: orina, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido ascítico, sangre, pus de cavidades abiertas, biopsias de piel, hueso, aspirado gástrico, lavado bronquial, etc.

2. MATERIALES REQUERIDOS ✓ Portaobjetos ✓ Cubreobjetos

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✓ ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ ✓

Asas de inoculación Mechero Bunsen Pipetas Hisopos Colorantes para gram y ZIEHL-NEELSEN Solución salina aplicadores soporte para los extendidos lápiz para marcar láminas portaobjetos

3. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA PROCEDIMIENTO: El p de la tinción de Gram consiste en fijar el material orgánico a la superficie del portaobjetos del microscopio ya descrito. REACTIVOS: • cristal violeta o violeta de genciana • lugol o disolución de Lugol • Alcohol cetona • Safranina Primer paso en la tinción de Gram es la aplicación del c )p . Luego se lava con agua corriente abundante, aplica un mordiente, el yodo de Gram (lugol), para que el colorante alcalino se una a la pared celular a través de enlaces químicos por un minuto y se lava. El tercer paso la decoloración distingue las bacterias gram positivas de las gram negativas y se realiza con alcohol acetona por 30 segundos y se lava. Después de la decoloración los microorganismos aparecen como gram positivos retienen el cristal violeta y los gramnegativos lo pierden. El último paso agregar colorante de contraste safranina (Contra tinción) teñirá de color rosa o rojo las bacterias gramnegativas claras por un minuto y se lava. Después de todo esto se deja secar. OBSERVACION DE LA TINCION DE GRAM. Una vez teñido el frotis se observa con el ). Cuando el material orgánico se tiñe con Gram (p. ej., frotis directo) el portaobjetos se evalúa en busca de la presencia de células bacterianas así como de las reacciones Gram, (Fig. 3) En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones: • Identificación preliminar de la bacteria causal de la infección.

Técnica coloración ZIEHL-NEELSEN • Ubicar al lado de la mesa el recipiente para descartar el material con tapa • Para cada muestra, numerar una lámina portaobjetos,

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• r . • Destapar con cuidado el envase. • Partir un aplicador en dos, tratando de que las puntas queden ásperas. • Tomar una parte del aplicador seleccionar la p s . •Colocar la(s) partícula(s) seleccionada(s) sobre el portaobjetos y extenderla(s) de acuerdo a procedimiento de extensión del frotis descrito anteriormente. REACTIVOS: • Fucsina fenicada básica • Alcohol acido 3,0 % • Azul de metileno COLORACIÓN EN CALIENTE PROCEDIMIENTO: 1.- Se fija la muestra al portaobjetos c . 2.- Se cubre el frotis con papel filtro 3.- Colocamos el reactivo de colorante de carbolfuscina cubriendo todo la placa 4.- Se calienta con suavidad hasta la aparición de vapores mediante flameo por debajo de la rejilla de sostén con un mechero de gas, si el colorante se evapora demasiado se coloca más, se deja actuar el colorante sobre el portaobjetos durante 5 minutos. 5.- Se retira el papel filtro, inclina el frotis para eliminar el exceso de colorante y se lava con agua destilada con un chorro constante y no fuerte. 6.ác 3 i sc . 7.- Se cubren los frotis con reactivo de azul de metileno durante 1 minuto. 8.- Se lavan con agua destilada y se dejan secar al aire. 9.- Se examinan con aceite de inmersión en búsqueda de BAAR5. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE LAS MYCOBACTERIAS Los bacilos acidorresistentes tienen entre 1 y l0 μm de largo. Con la coloración de Ziehl Neelsen se observan como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia, destacándose claramente contra el fondo azul. A veces se observan con gránulos o cuentas intensamente coloreados en el interior, pueden aparecer como bastones muy largos o como bacilococos. RESULTADOS: Positiva bacilos rojos delgados en rosario BAAR Negativo ausencia de bacilos rojos delgados en rosario en 100 campos no BAAR Un hallazgo positivo significa “p s” y un hallazgo negativo significa “ausencia de bacilos alcohol acido resistentes”.

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AUTOEVALUACION E INVESTIGACION 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Cite 2 ejemplos de microorganismos gram positivos y gram negativos. Enumere 3 diferencias entre gram positivos y gram negativos Investigar que debe constar en un reporte (resultado) de coloración de Gram? Indicaciones para solicitar una coloración de gram y ZIEHL-NEELSEN En una coloración de gram se reporta detritus celulares cual es la importancia? En el reporte de gram se indica la presencia de bacterias por cruces (+) o número por campo (1-2xc) que es lo correcto?

BIBLIOGRAFÍA 1. 2. 3.

Koneman, E. Diagnostico microbiológico, Editorial médico panamericana, Jawetz Ernest, Microbiología médica, 17ª edición en español, Manual moderno, México, México 2002. Bailey & Scott, Diagnóstico microbiológico, 11ª edición, Editorial Panamericana, Buenos Aires – Argentina, 2 004.

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Universidad Central del Ecuador Facultad de Ciencias Médicas Carrera de Medicina PRE-REQUISITOS DE MICRO MICROBIOLOGIA BIOLOGIA NOMBRE: FECHA: PARALELO:

DOCENTE: AYUDANTE: GRUPO:

PREGUNTA 1.

PREGUNTA 2

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Universidad Central del Ecuador Facultad de Ciencias Médicas Carrera de medicina POST-REQUISITOS DE MICROBIOLOGIA NOMBRE: FECHA: PARALELO:

DOCENTE: AYUDANTE: GRUPO:

PREGUNTA 1.

PREGUNTA 2

PREGUNTA 3

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