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Fundamento de la coloración Gram, de Capsulas y de Esporas

I.

Fundamento de la coloración Gram

Es el método más importante usado en las prácticas de microbiología general, llamado así en honor al Dr. Hans Christian Gram. Para Gil (2019) nos dice que, es una técnica que presenta cuatro pasos fundamentales: tinción, fijación con el mordiente, decoloración y contratinción. Por lo tanto, esta técnica además de colorear a las bacterias, también permite diferenciarlas. El cristal violeta es el primer colorante utilizado. El mismo tiene afinidad por el peptidoglicano y teñirá de morado a todas las bacterias presentes, posteriormente se coloca el Lugol, que actúa como mordiente, es decir, inducirá a la formación de complejos insolubles de cristal violeta-yodo – proteínas ribonucleares dentro de la célula.[ CITATION Gil19 \l 2058 ] En estos dos primeros pasos fundamentales, permite que en las bacterias Gram positivas, al tener una pared gruesa de peptidoglicano, forman más complejos (cristal violeta-yodo), por tanto, retienen el colorante. Además, también influye que la pared de las bacterias Gram positivas contienen mayor cantidad de ácidos no saturados, los cuales muestran gran afinidad por los agentes oxidantes (Lugol). Mientras que en las bacterias Gram negativas poseen una capa delgada de peptidoglicano, lo que hace que las bacterias formen menos complejos que las Gram positivas.

Posteriormente viene el tercer y cuarto paso que es la decoloración y la contratación, donde las bacterias Gram positivas y Gram negativas se comportan de manera diferente. En el caso de las bacterias Gram negativas, al contener una membrana externa rica en lipopolisacáridos que forma parte de su pared celular. Las grasas son destruidas durante la decoloración por el contacto con el alcohol acetona, por lo que la membrana externa se desestabiliza, siendo liberado el cristal violeta. Es así como luego es contrateñida con la safranina o fucsina básica, tomando el color rojo. En el caso de las bacterias Gram positivas, resisten la decoloración porque el decolorante actúa cerrando los poros, lo que impide que el complejo cristal violeta/yodo pueda salirse. Por tanto, se mantiene estable la coloración con el cristal violeta, y no hay cabida para la safranina o la fucsina. Por esto estas bacterias se tiñen de azul intenso o morado.

II.

Fundamento de la coloración de capsulas

La capsula bacteriana es la capa rígida con borde definido formada por una serie de polímeros orgánicos que en las bacterias se deposita en el exterior de su pared celular. Generalmente contiene glicoproteínas y un gran número de polisacáridos diferentes, incluyendo polialcoholes y amino azucares. [ CITATION Núñ18 \l 2058 ]Esta capa rígida está organizada en matriz impermeable que excluye colorantes como la tinta china y el rojo Congo. En cambio, la capa de material extracelular que se deforma con

facilidad, es incapaz de excluir partículas y no tiene un límite definido, se denomina capa musoca o glucocalix.

La capsula les sirve a las bacterias de cubierta protectora resistiendo la fagocitosis, y por lo tanto es una estructura difícil de penetrar. Es por ello que las tinciones de cápsulas se fundamentan en el contraste. Los colorantes tiñen el fondo de la preparación mientras que la cápsula queda incolora.

La tinción rojo Congo o llamada también tinción Maneval es una técnica que ayuda a reconocer fácilmente las cápsulas. Utilizando el colorante rojo Congo para que tiña el fondo del frotis, y el mordiente para la afinidad del material celular y del colorante uniendo a ambos. Si el microorganismo no posee cápsula no será distinguible con este tipo de coloración, porque todo se teñirá del mismo color.

Existe otras técnicas que se utilizan para colorear la cápsula, poseen el mismo fundamento a pesar de que utilizan colorantes y procedimientos diferentes. No olvidar que la tinción rojo Congo es la variante de la tinción negativa que utiliza la tinta china como colorante.

III.

Fundamento de la coloración de esporas

En algunas bacterias que pertenecen al género Bacillos y Clostridium, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Y esta se crea cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes,

temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.) formándose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante años.

Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción. Es por ello que para su coloración se requiere de la Técnica de Shaeffer–Fulton o Wirtz-Conklin. Su procedimiento consiste en utilizar el verde de malaquita, el cual entra a las células vegetativas y, al aplicarle calor, penetra en la endospora y también en las exosporas. Al lavar con agua, el colorante se elimina de la célula vegetativa. Esto ocurre porque el tinte verde de malaquita es ligeramente básico, por lo que se une débilmente a la célula vegetativa. En cambio, no puede salirse de la espora y finalmente se contratiñe el bacilo con safranina, colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.

IV.

Referencias bibliográficas Fernandez, A. (11 de 10 de 2016). Practica 5 Gram- Maneval. Obtenido de https://es.scribd.com/document/327120539/Practica-5-Gram-Maneval

Gil, M. (19 de 01 de 2019). Tinción de esporas: fundamento, técnicas y usos. Obtenido de https://www.lifeder.com/tincion-de-esporas/ Gil, M. (09 de 08 de 2019). Tinción de Gram: fundamento, materiales, técnica y usos. Obtenido de https://www.lifeder.com/tincion-de-gram/ Núñez

,

J.

(2018).

Tinciones

selectivas:

Tincion

de

capsula”.

Obtenido

de

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