Metodos DE Coloracion PDF

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PRACTICA METODOS DE COLORACION BACTERIANA INTRODUCCION En general las bacterias y otros microorganismos son transparentes, lo que dificulta su estudio cuando los exámenes se realizan en fresco. Por tal razón, cuando se quiere conocer los detalles morfológicos, es necesario recurrir a tinciones Los colorantes son compuestos químicos orgánicos que al unirse a la célula bacteriana van a permitir visualizar su identificación final del microorganismo. Así todos los colorantes usados en microbiología son derivados del alquitrán de hulla (anilinas), todos poseen en su fórmula química anillos benceno; la diferencia entre uno y otro colorante está en el número de anillos que posee, su disposición y la sustitución de los átomos de hidrógeno por otras moléculas. Los colorantes se dividen en ácidos, básicos o neutros. En los colorantes ácidos (eosina, fucsina ácida, azul de anilina, fluoresceina) el grupo iónico que imparte el color, llamado también cromóforo tiene carga negativa y reacciona con colorantes básicos (azul de metileno, violeta de genciana, fucsina básica, safranina, cristal violeta) el cromóforo tiene carga positiva y reacciona con sustancias ácidas como son Los ácidos nucleicos. Los colorantes neutros están compuestos por colorantes ácidos y básicos [hematoxilina (básico), eosina (ácida)]. En general las bacterias tienen afinidad por los colorantes derivados de la anilina o aquellos especialmente. Estos colorantes llevan en su parte cromógena carga eléctro positiva, la que tendría una fuerte afinidad por los grupos eléctro negativo, que normalmente presentan las bacterias en su protoplasma, entre los cuales se encuentran los ácidos nucleicos y derivados. OBJETIVO GENERAL  Distinguir y diferenciar a las bacterias mediante métodos de coloración. OBJETIVOS ESPECIFICOS:  Utilizar el método simple para la coloración bacteriana.  Realizar la coloración Gram y Ziehl Neelsen como métodos de coloraciones compuestas. RECOMENDACIONES GENRALES PARA CUALQUIER COLORACION Cualquiera de las técnicas de coloración bacteriana, implica cuidadoso procedimiento del material a colorearse, para esto se recomienda seguir las siguientes etapas.  Extendido o frotis: La lámina debe estar transparente, desengrasada y limpia. Si el cultivo es líquido, con el asa de siembra esterilizada previamente, tomar 1 o 2 gotas y extender suavemente sobre la lámina portaobjeto. Si el cultivo es sólido, primero colocar con el asa una gota de agua destilada estéril sobre el portaobjeto y luego tomar el inóculo: emulsionar y extender suavemente sobre la lámina portaobjeto.  Fijación: Someter el frotis a la llama del mechero con calentamiento moderado o con alcohol de 70%, Metanol u otro líquido fijador, según la técnica.  Coloración: Cubrir la extensión fijada. Evitar evaporación por el tiempo que debe actuar. Se intensifica la coloración con el uso de mordientes como el lugol en el caso de la tinción Gram, ácido tánico para teñir flagelos, etc. El tiempo varía de acuerdo a la técnica.  Diferenciación: Con alcohol simplemente, alcohol acetona, alcohol ácido como agentes decolorantes, el empleo de cada uno depende de la técnica, debe dejarse actuar hasta que el líquido pase incolora, para desprender el exceso de colorantes.  Lavado: con agua corriente, para secar el exceso del diferenciador, en algunos casos se recomienda usar agua destilada.  Recoloración: Para tinción de estructuras que se decoloran por acción de los diferenciadores hacer actuar los colorantes de contrastes, el tiempo varía según la técnica.  Lavado final: A chorro continuo de agua corriente hasta que arrastre todo exceso de colorante. Es preferible para algunas técnicas, el uso de agua destilada.  Secado: Preferible al ambiente colocando el preparado inclinando para el escurrimiento y con el frotis protegido del polvo o impurezas

I. COLORACION SIMPLE. Son aquellas coloraciones en las que se utiliza sólo un colorante que va a permitir visualizar la morfología de los microorganismos. Se puede utilizar la fucsina o un colorante azul (azul de metilo, azul de toluidina, azul de tionina) que nos permita apreciar la morfología de una gran variedad de bacterias. MATERIALES:  Cultivo recientes en agar y caldo nutritivo de diferentes microorganismos.  Solución colorante: Azul de metileno.  Porta objetos limpios.  Asa y aguja de siembra.  Mechero.  Microscopio y aceite de inmersión PROCEDIMIENTO  Realizar el extendido o frotis.  Fijar el frotis a la llama del mechero.  Cubrir la extensión fijada con solución de azul de metileno por 30” 1’  Quitar el exceso de colorante vaciándolo y enjuagando suavemente en una muy leve corriente de agua.  Dejar secar.  Observar al microscopio utilizando lente de inmersión. RESULTADOS Realizar dibujos respectivos de lo que se observó. Dar especial atención a la disposición de las células, sus formas y tamaños relativos.

II. COLORACION COMPUESTA A. COLORACION GRAM En 1844, el médico danés Gram, inventó un método especial para tinción de valor práctico, taxonómico en bacteriología. Este método sirve para dividir a las bacterias en dos grupos: GRAM POSITIVOS Y GRAM NEGATIVOS. Se ha estudiado mucho desde su inicio hasta nuestros días, el mecanismo íntimo de la coloración Gram, sugiriendo varias teorías al respecto. La mas generalizada es que la violeta de genciana (cristal violeta) con el lugol (mordiente) forma en al célula el complejo carbohidrato – proteína ribonucleato de magnesio, el cual el ser tratados con el alcohol acetona la bacteria no sede el colorante, quedando teñida de violeta (Gram Positiva). En cambio, las que seden el colorante por el tratamiento con el diferenciador, queda incoloras y por el colorante de contraste (fuscina básica o safranina) que las tiñe de rojo pueden ser observadas (Gram Negativas). Recientemente estudios comparativos atribuyen el carácter de Gram positividad a la estructura química de las paredes celulares; entre otras principalmente al contenido de lípidos. En las Gram positivas la permeabilidad de las paredes resistentes pudiendo decrecer por el efecto deshidratante del alcohol, mientras que en las Gram negativas el alcohol extracta de sus paredes el alto contenido de lípidos aumentando la permeabilidad, fácilmente escapando el complejo cristal violeta – yodo o violeta de genciana – yodo. MATERIALES  Cultivos de 24 horas de diferentes microorganismos en agar nutritivo.  Reactivos de tinción Gram:  Cristal violeta.  Lugol  Alcohol acetona.  Safranina.  Portaobjetos.  Asa de siembra.  Mechero.  Microscopio y aceite de cedro.

PROCEDIMEINTO:  Preparar el frotis y fijar a la llama del mechero.  Cubrir el frotis con cristal violeta, durante 1 minuto.  Lavar en chorro de agua suave,  Aplicar lugol y dejar reaccionar por 1 minuto.  Lavar con agua corriente.  Decolorar con alcohol acetona, hasta que la tintura ya no fluya del frotis.  Lavar inmediatamente con agua corriente.  Cubrir el frotis con safranina durante 30 segundos.  Lavar con agua corriente y secar al ambiente.  Observar al microscopio con lente de inmersión, aplicando una gota de aceite de cedro. RESULTADOS Y OBSERVACIONES Las bacterias Gram Positivas son teñidas de color Azul y las bacterias Gram Negativas son teñidas de color rojo. B. COLORACION ZIEHL NEELSEN Existe un importante grupo de bacterias que no se tiñen con la coloración Gram, debido a que su pared es particularmente gruesa, por la presencia de lípidos, que la hace impermeable a los colorantes. Tal es el caso del género Mycobacterium. La coloración diferencial de Ziehl Neelsen permite colorear a estos microorganismos. Tanto el fenol contenido en el colorante primario como el calor de la llama aplicada a la lámina, ayudan a disolver los lípidos de la pared bacteriana de tal manera que permite el ingreso del colorante a la célula. Una vez colorada este grupo bacteriano no se deja decolorar por el alcohol – ácido. Estas son denominadas bacterias alcohol ácido resistentes. MATERIALES  Esputo.  Batería de la coloración:  Fucsina fenicada.  Alcohol ácido.  Azul de metileno.  Láminas Portaobjetos.  Asas de siembra  Mechero  Microscopio y aceite de inmersión. PROCEDIMIENTO  Con sumo cuidado, tomar con el asa de siembra estéril, un poco de esputo y extender sobre la lámina sin llegar a los bordes.  Quemar el asa para eliminar el exceso de inoculo.  Secar al aire y fijar al calor.  Cubrir la preparación con el colorante fucsina fenicada y dejarlo por 30 a 60 segundos.  Calentar el preparado con suavidad, calentar la lámina con el mechero de alcohol, hasta observar el desprendimiento de vapor. Evitar que el colorante hierva, repetir la operación durante tres veces.  Dejar enfriar y lavar con agua corriente.  Decolorar con el alcohol ácido, hasta que ya no fluya colorante del frotis. ( 2 minutos)  Lavar con agua corriente.  Cubrir con azul de metileno durante 30 a 60 segundos.  Secar la muestra.  Observar al microscopio con aceite de inmersión RESULTADOS Las bacterias alcohol ácido resistentes se tiñen de color rojo sobre un campo de contraste azul. Los resultados son reportados de acuerdo a las normas de la Organización Mundial de Salud. ( Negativo): No se encuentran bacilos BAAR en 100 campos. Paucibacilares : Se observa de 1 a 9 BAAR en 100 campos.

(+) (++) (+++)

: Menor de 1 BAAR por campo (10 –99 BAAR) en 100 campos. : De 1 a 10 BAAR por campo (Revisar 40 campos) : Mas de 10 BAAR por campo (Revisar 20 campos).

PRACTICA COLORACION DE ESTRUCTURAS BACTERIANAS. Según su estructura las bacterias van ha reaccionar de manera diferente a los colorantes. Las bacterias poseen elementos estructurales obligados (pared celular, membrana citoplasmática, citoplasma y núcleo) y elementos facultativos (cápsula, flagelos, fimbrias, esporas,) OBJETIVO  Diferenciar las estructuras bacterianas por diferentes métodos de coloración

FLAGELO BACTERIANO Los flagelos bacterianos son apéndices largos y delgados libres por uno de sus extremos y unidos a la célula por el otro. Son tan delgadas (cerca de 20nm) que un flagelo solo, nunca podrá ser visto directamente con el microscopio de luz, sino se emplean colorantes especiales para teñirlos. Una de las tinciones más frecuentes para flagelos se emplea el colorante básico fucsina con ácido tánico como mordiente. El mordiente favorece la unión de las moléculas del colorante con el flagelo y se forma un precipitado a todo lo largo del flagelo haciendo visible al microscopio de luz. Los flagelos también pueden ser observados con microscopio electrónico por medio del sombreado. Los flagelos se disponen de manera diferente en bacterias: flagelación polar que pueden ser monotricos, lofotricos, anfitricos y flagelación perítrica. Los flagelos no tiene una forma recta sino helicoidal, están compuestas de subunidades de una proteína denominada flagelina. La composición de los amino ácidos de la flagelina es de alguna manera excepcional, contienen baja cantidad de aminoácidos aromáticos que contienen azufre, mientras que es abundante los ácidos aspártico y glutámico y la longitud de honda del flagelo está determinada por las estructuras de la proteínas flageladas. MATERIALES:  Lámina Portaobjetos.  Asa de kolle.  Cultivo reciente en agar semisólido de un microorganismo flagelado  Mordiente Gray Acido tánico, solución acuosa 20% 2ml HgCl, solución saturada 2ml Alumbre, solución saturada 5ml Fucsina básica, solución alcohol saturada 0.4ml  Fucsina fenicada de Ziehl Neelsen PRECAUCIONES: Preparación de la lámina  Debe usarse en los posible láminas nuevas.  Sumergir las láminas en solución sulfocrómica, lavar con agua y luego con alcohol de 95°  Secar con papel absorbente.  Flamear sobre la llama, hasta que comience a adquirir un color naranja.  Dejar enfriar lentamente. Preparación de frotis  Sembrar en agar inclinado el microorganismo flagelado e incubar a 37°C por 18 horas.

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Tomar con el asa de kolle una pequeña cantidad de crecimiento húmedo. Sumergir en un pequeño volumen de agua destilada estéril e incubar a temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Tomar una gota de suspensión con asa de kolle y observar la motilidad por medio de la gota pendiente. Con una pipeta capilar retirar una pequeña gota de la superficie de la suspensión y colocarla en un extremo de la lámina debidamente preparada, inclinándolo de modo que la gota se deslice lentamente en el sentido longitudinal. Dejar secar la lámina en posición longitudinal.

 . PROCEDIMIENTO  Tomar una pequeña porción de la suspensión bacteriana y extender sobre la lámina portaobjeto en forma suave para evitar ruptura de los flagelos  Secar al ambiente nunca al calor.  Aplicar el mordiente de Gray por 15 minutos.  Lavar con agua.  Secar al aire.  Teñir con fucsina de Ziehl Neelsen durante 5 minutos en frío.  Lavar el exceso con agua y secar.  Observar al microscopio con el objetivo de inmersión. RESULTADOS Se observará el cuerpo bacteriano teñido en rojo y sus flagelos rosados apreciándose el número y la distribución de los mismos.

CAPSULA BACTERIANA GENERALIDADES La cápsula bacteriana aunque es externa a la célula, se sintetiza parcialmente dentro del citoplasma y es probable que la síntesis continúe dentro de la región de la pared celular antes de que se deposite la cápsula. Aunque no se detecten en muchas bacterias, aparece bien desarrolladas en algunas, entre las que están Diplococcus pneumoniae, Clostridium perfringens y Klebsiella pneumoniae. Al parecer la cápsula aumenta la virulencia de algunos organismos al protegerlos de los mecanismos de defensa del hospedero que habitan y, además, imparten propiedades inmunológicas específicas a algunos microorganismos La cápsula bacteriana no tiene la misma afinidad por los colorantes que otros componentes celulares, de allí que algunos colorantes están destinados a colorear la célula y el fondo, pero no la cápsula, de modo que la envoltura se aprecia por el contraste (Método de Anthony). Otros métodos producen un efecto colorante diferencial, cuando la cápsula admite un contracolorante (Método de Hiss). Otro procedimiento utiliza el principio de la coloración negativa, observándose la cápsula como un halo contra un fondo oscuro (Método de la tinta china). Muchas de las bacterias capsuladas y algunas no capsuladas secretan extracelularmente un material viscoso, generalmente compuestos de polisacáridos denominados cápsula musilagionosa. Estos pueden ser vistos en preparaciones hechas por alguno de los métodos usados para la coloración de cápsula. Las capas misilagionosas aparecen como masas irregulares de material amorfo entre el cuerpo bacteriano y la cápsula OBSERVACION DIRECTA DE CAPSULA BACTERIANA MATERIAL  Tinta china, densa y solamente de partículas finas.  Láminas portaobjetos.  Cultivo reciente de un microorganismo capsulado (6 horas)  Medio de cultivo: Wolfel – Ferguson líquido y sólido. MEDIO AGAR WOLFEL – FERGUSON

El medio favorece la producción de cápsula. Formula Cloruro de sodio 2,0g Sulfato de potasio 1,0g Sulfato de magnesio 0,25g Sacarosa 20,0 g Extracto de levadura 2,0g Agar – agar 18,0g Agua destilada c.s.p. 1000ml pH 7.2 Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos, repartir en placas petri. PROCEDIMIENTO  Colocar una gota gruesa de tinta china concentrada en un portaobjeto limpio y desengrasado.  Emulsificar con la tinta china una colonia de un cultivo sólido o el sedimento de un cultivo en caldo centrifugado.  Colocar un cubreobjeto limpio sobre la mezcla y presionar suavemente con una hoja de papel secante.  Colocar una gota se aceite de cedro. Observar con lente de inmersión. RESULTADOS Las cápsulas aparecen como zonas claras iluminadas entre el contorno refráctil de la célula y el fondo oscuro por la tinta

COLORACION DE CAPSULA METODO DE HISS Reactivos:  Cristal violeta en solución acuosa al 20%  Solución acuosa de sulfato de cobre al 2% Método  Recoger con el asa de siembra, una suspensión de crecimiento de solución fisiológica, y colocarlos al portaobjeto que contiene 1 gota de suero fisiológica. Dejar secar el extendido a temperatura ambiente y fijar por calentamiento.  Bañar el preparado con cristal violeta.  Pasar el preparado por vapor suave durante 1 minuto.  Lavar con la solución acuosa de sulfato de cobre. RESULTADOS. La cápsula aparece en forma de halo de color azul pálido alrededor de las que toman un color azul oscuro o púrpura.

COLORACION DE ESPORAS FUNDAMENTO La aplicación de un colorante primario en solución acuosa en caliente incrementa la penetración de los recubrimientos relativamente impermeable a las esporas. Las esporas sometidas correctamente al método resistirá la sustitución por el colorante de contraste. En esta forma se puede determinar la ubicación intracelular de las esporas de ciertos microorganismos. MATERIALES  Lámina portaobjeto.  Verde de malaquita 5% en solución acuosa.  Safranina al 0.5% en solución acuosa.  Cultivo en agar nutritivo de 48 horas de Bacillus subtilis.

PROCEDIMIENTO  Preparar frotis del cultivo proporcionado, dejar secar y fijar con la mínima cantidad de calor.  Cubrir la preparación con solución de verde de malaquita.  Someter a vapor de agua durante 5 minutos.  Dejar enfriar la preparación por 5 minutos  Lavar con agua  Agregar la Safranina durante 1 minuto.  Lavar y secar.  Observar al microscopio utilizando lente de inmersión. RESULTADO Se podrán observar esporas verdes dentro células rojas...